Generazione di modelli per microscopia a trazione micropattern

Summary

Descriviamo i miglioramenti a un metodo standard per misurare le forze di trazione cellulare, basato sulla stampa di microcontatti con una singola fase di pattern sottrattiva di array di punti di proteine della matrice extracellulare su idrogel morbidi. Questo metodo consente una fabbricazione più semplice e coerente dei modelli a isola, essenziale per controllare la forma del cluster cellulare.

Abstract

La microscopia a trazione micropattern consente il controllo della forma di singole cellule e cluster cellulari. Inoltre, la capacità di modellare la scala di lunghezza micrometrica consente l’uso di queste zone di contatto modellate per la misurazione delle forze di trazione, poiché ogni punto micropatternato consente la formazione di una singola adesione focale che quindi deforma l’idrogel morbido sottostante. Questo approccio è stato utilizzato per una vasta gamma di tipi di cellule, tra cui cellule endoteliali, cellule muscolari lisce, fibroblasti, piastrine e cellule epiteliali.

Questa recensione descrive l’evoluzione delle tecniche che consentono la stampa di proteine della matrice extracellulare su idrogel di poliacrilammide in una serie regolare di punti di dimensioni e spaziatura prespecificate. Poiché i modelli su scala micrometrica sono difficili da stampare direttamente su substrati morbidi, i modelli vengono prima generati su coperture di vetro rigido che vengono quindi utilizzate per trasferire il modello all’idrogel durante la gelificazione. Innanzitutto, viene descritto l’approccio originale di stampa a microcontatto per generare matrici di piccoli punti sul coperchio. Un secondo passaggio che rimuove la maggior parte del modello per lasciare isole di piccoli punti è necessario per controllare le forme di celle e cluster di celle su tali matrici di punti modellati.

Successivamente, viene descritta un’evoluzione di questo approccio che consente la generazione di isole di punti utilizzando un singolo passaggio di pattern sottrattivo. Questo approccio è notevolmente semplificato per l’utente, ma ha lo svantaggio di una durata ridotta per lo stampo principale necessario per realizzare i modelli. Infine, vengono descritti gli approcci computazionali che sono stati sviluppati per l’analisi delle immagini dei punti spostati e dei successivi campi di trazione generati dalle cellule e vengono fornite versioni aggiornate di questi pacchetti di analisi.

Introduction

La maggior parte dei fenotipi cellulari esercita forze di trazione sul loro ambiente. Queste forze di trazione sono generate dal citoscheletro contrattile di una cellula, che è una rete di actina e miosina, e altri biopolimeri filamentosi e proteine reticolanti 1,2,3,4. Le forze generate all’interno della cellula possono essere trasmesse all’ambiente extracellulare o alle cellule adiacenti, principalmente attraverso proteine transmembrana come integrine e caderine, rispettivamente ^5,6. Il modo in cui una cellula si diffonde o si contrae – e le grandezze delle forze di trazione associate a quei movimenti – è il risultato di una conversazione intima con il suo ambiente, che dipende in gran parte dal tipo e dalla quantità di proteina presente nella matrice extracellulare (ECM)^7,8 e dalla rigidità dell’ECM. In effetti, la microscopia con forza di trazione è diventata uno strumento inestimabile per comprendere la reattività cellulare a stimoli locali come la rigidità del substrato, le sollecitazioni e le tensioni meccaniche imposte o il contatto con altre cellule. Queste informazioni sono direttamente rilevanti per la comprensione di malattie come il cancro e l’asma 9,10,11,12.

Per calcolare le forze di trazione è necessario un sistema che può essere utilizzato per misurare la deformazione indotta dalla forza di un substrato con proprietà note del materiale. Questi cambiamenti devono essere monitorati nel tempo, richiedendo tecniche di imaging e di elaborazione delle immagini. Uno dei primi metodi utilizzati per determinare le forze di trazione cellulare è stata l’osservazione e l’analisi della contrazione di idrogel di collagene seminati con cellule, sebbene questo metodo fosse solo semiquantitativo¹³. Un altro metodo più raffinato è stato quello di misurare le forze di trazione esercitate dalle singole celle determinando le forze risultanti dalla deformazione di un sottile foglio di silicone¹⁴. Successivamente, sono state sviluppate tecniche di misurazione più quantitative e questi metodi hanno anche permesso l’uso di idrogel morbidi come la poliacrilammide (PAA)12,15,16. Quando si utilizzano questi materiali morbidi, le forze di trazione potrebbero essere determinate dallo spostamento indotto dalla forza di perline spostate casualmente incorporate nell’idrogel e dalle proprietà meccaniche del gel^16,17. Un altro progresso è arrivato con lo sviluppo di array di micropost fatti di polidimetilsilossano morbido (PDMS) in modo che la loro deflessione potesse essere misurata e convertita in forza usando la teoria del fascio¹⁸.

Infine, sono stati sviluppati metodi per la micropatterazione di idrogel morbidi in quanto questi approcci consentono il controllo delle aree di contatto per l’adesione cellulare. Misurando la deformazione del micropattern all’interno dell’area di contatto di una cella, le forze di trazione potrebbero essere facilmente calcolate perché non è richiesta un’immagine di riferimento priva di forza¹⁹. Questo metodo è stato ampiamente adottato in quanto consente il pattern indiretto di una serie regolare di punti di adesione di proteine fluorescenti discrete di dimensioni micron su gel PAA per la misurazione delle forze di trazione cellulare²⁰. Per calcolare queste forze, è stato sviluppato un algoritmo di elaborazione delle immagini, in grado di tracciare i movimenti di ciascun punto micropatterato senza richiedere l’input dell’utente²¹.

Mentre questo metodo è semplice per creare intere griglie di modelli di punti, è più complicato quando si desiderano modelli di patch isolate (o isole) di punti. Le isole micropatternate sono utili quando è necessario il controllo della forma, e in una certa misura delle dimensioni, dei gruppi di cellule. Per creare queste isole, il suddetto metodo di stampa a microcontatto richiede due passaggi distinti: i) utilizzando un timbro PDMS per creare un modello ad alta fedeltà di punti su una copertina, e quindi ii) utilizzando un secondo timbro PDMS diverso per rimuovere la maggior parte di quei punti, lasciando dietro di sé isole isolate di punti²¹. La difficoltà nel creare isole con questo metodo originale è aggravata dal fatto che creare modelli di griglia coerenti nella prima fase del processo è impegnativo da solo. I timbri di microstampa sono composti da una serie di micropost circolari, il cui diametro corrisponde alla dimensione del punto desiderata. Questi timbri vengono quindi rivestiti con uno strato uniforme di proteine e quindi stampati con una precisa quantità di pressione sulle coperture trattate per creare il modello desiderato. Da un lato, l’applicazione di troppa pressione sul timbro può comportare un trasferimento irregolare delle proteine e una scarsa fedeltà del modello a causa della deformazione del pilastro o del cedimento tra i pilastri, che porta al contatto con il vetro. D’altra parte, l’applicazione di una pressione troppo bassa si traduce in un trasferimento di proteine scarso o nullo e in una scarsa fedeltà del modello. Per questi motivi, è necessario un processo di trasferimento che possa essere utilizzato per creare costantemente micropattern di alta qualità di isole isolate di punti in un solo passaggio.

Qui, viene descritto un metodo per la micropatterning indiretta di isole di punti di adesione di proteine fluorescenti di dimensioni micron su un gel PAA che è più coerente e versatile rispetto ai metodi precedentemente sviluppati. Mentre i vecchi metodi di micropatterning indiretto si basano sul trasferimento di modelli proteici da un timbro PDMS a un substrato intermedio, il metodo introdotto qui utilizza i timbri PDMS invece come un vaso per la rimozione delle proteine, non l’aggiunta. Questo viene fatto cambiando prima radicalmente la struttura dei timbri PDMS utilizzati. Piuttosto che creare francobolli composti da un modello di pilastri circolari uniformemente distanziati, i francobolli sono costituiti da un modello di fori circolari uniformemente distanziati in questo metodo.

Con questa nuova struttura, la superficie di questi timbri PDMS può quindi essere trattata con glutaraldeide come descritto in precedenza^20,29,30, rendendo il timbro in grado di legarsi covalentemente con le proteine. Se utilizzati su un coperchio di vetro uniformemente rivestito con proteine fluorescenti, questi timbri PDMS trattati con glutaraldeide vengono utilizzati per rimuovere la maggior parte delle proteine sulla superficie del coperchio, lasciando dietro di sé solo il modello desiderato di punti predeterminati dalla posizione di fori di dimensioni micron sul timbro. Questo cambiamento aumenta il tasso di successo per la generazione di modelli costituiti da una griglia quasi continua di punti e per la creazione di isole isolate di punti attraverso un solo passaggio.

Protocol

1. Creazione di master in silicone NOTA: la maggior parte del processo di progettazione, creazione e risoluzione dei problemi dei master in silicio per lo stampaggio ripetuto di timbri PDMS è stato trattato in precedenza21, quindi qui verranno descritte solo le differenze chiave in questo nuovo approccio. Creare il design per la maschera fotografica utilizzando AutoCAD o software di progettazione simile. Rivestire un lato della fotomaschera, …

Representative Results

Gli idrogel PAA con il modulo di Young di E = 3,6 kPa e il rapporto di Poisson di ν = 0,445 sono stati fatti per l’uso con questo metodo di micropatterning sottrattivo. Gli idrogel sono stati realizzati per avere uno spessore di ~ 100 μm, il che consente loro di essere ripresi con la configurazione di imaging utilizzata qui, impedendo allo stesso tempo alle cellule di rilevare il coverslip rigido sotto il gel, il che causerebbe problemi negli studi incentrati sul rilevamento della rigidità cellulare<…

Discussion

Un metodo migliorato per modellare indirettamente gli idrogel PAA è descritto in questo articolo. Questo approccio si basa su metodi che sono stati utilizzati in precedenza 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Il cambiamento princ…

Materials

(3-aminopropyl)trimethoxysilane	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL conical tube	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask	Advance Reproductions Corporation	N/A	Custom-designed mask
6 Well Plates	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Aminonium Persulfate	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrylamide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round	Fisher Scientifc	#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Mask Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope	Olympus	#IX81
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Silicon Wafers, 100 mm	University Wafer	#809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9463827
SU-8 Developer	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine	Fisher Scientific	#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objective	Olympus	#N2709300
UV Flood Exposure	Newport	#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40