다중 모드 비선형 광학 현미경을 사용한 나노 입자의 세포 흡수의 생체 분자 이미징
Summary
이 기사에서는 스펙트럼 초점 모듈과 이중 출력 펄스 레이저의 통합을 제시하여 금 나노 입자와 암세포의 신속한 초분광 이미징을 가능하게 합니다. 이 작업은 표준 레이저 스캐닝 현미경에서 다중 모드 비선형 광학 기술의 세부 사항을 시연하는 것을 목표로 합니다.
Abstract
살아있는 시스템에서 금 나노 입자 (AuNP)를 조사하는 것은 AuNP와 생물학적 조직 간의 상호 작용을 밝히는 데 필수적입니다. 또한 자극 라만 산란(SRS), 2광자 여기 형광(TPEF) 및 과도 흡수(TA)와 같은 비선형 광 신호를 이미징 플랫폼에 통합하여 세포 구조 및 AuNP의 생체 분자 대비를 다중 모드 방식으로 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 다중 모드 비선형 광학 현미경을 제시하고 이를 적용하여 암세포에서 AuNP의 화학적으로 특이적인 이미징을 수행합니다. 이 이미징 플랫폼은 보다 효율적인 기능화된 AuNP를 개발하고 종양, 세포 주위 또는 세포 공간을 둘러싼 혈관 구조 내에 있는지 여부를 결정하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다.
Introduction
금 나노입자(AuNP)는 다양한 생물의학 응용 분야에서 효과적인 표면 강화 라만 분광법(SERS) 기질과 같은 생체 적합성 이미징 프로브로서 큰 잠재력을 보여주었습니다. 주요 응용 분야에는 바이오 센싱, 바이오 이미징, 표면 강화 분광법 및 암 치료를위한 광열 요법과 같은 분야가 포함됩니다1. 또한 살아있는 시스템에서 AuNP를 탐색하는 것은 AuNP와 생물학적 시스템 간의 상호 작용을 평가하고 이해하는 데 중요합니다. 조직에서 AuNP의 분포를 조사하는 데 성공적으로 사용된 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광법2, 레이저 절제 유도 결합 질량분석법(LA-ICP-MS)3 및 자기 공명 영상(MRI)4을 포함한 다양한 분석 기술이 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 방법은 시간이 많이 걸리고 복잡한 샘플 준비3, 긴 획득 시간 요구 또는 서브 미크론 공간 분해능 2,4의 부족과 같은 몇 가지 단점이 있습니다.
기존의 이미징 기술과 비교하여 비선형 광학 현미경은 살아있는 세포 및 AuNP를 프로빙하는 데 몇 가지 이점을 제공합니다. 비선형 광학 현미경은 더 깊은 이미징 깊이를 달성하고 근적외선 초고속 레이저를 사용하여 본질적인 3D 광학 절단 기능을 제공합니다. 이미징 속도와 검출 감도가 크게 향상됨에 따라 2광자 여기 형광(TPEF)5,6,7 및 2차 고조파 생성(SHG)8,9,10 현미경이 살아있는 세포 및 조직에서 내인성 생체 분자의 비침습적 이미징을 더욱 개선하는 것으로 입증되었습니다. 또한 과도 흡수(TA)11,12,13,14 및 자극 라만 산란(SRS)15,16,17,18과 같은 새로운 펌프-프로브 비선형 광학 기술을 활용하여 세포 구조 및 AuNP의 표지 없는 생화학적 대비를 도출할 수 있습니다. 외부 라벨을 사용하지 않고 AuNP를 시각화하는 것은 나노 입자의 화학적 섭동이 물리적 특성을 수정하여 세포에서 흡수되기 때문에 매우 중요합니다.
이 프로토콜은 이중 파장 펄스 레이저를 위한 스펙트럼 포커싱 타이밍 및 재결합 장치(SF-TRU) 모듈의 구현을 제공하여 AuNP 및 암세포의 빠른 다중 모드 이미징을 가능하게 합니다. 이 작업은 레이저 스캐닝 현미경에서 통합 TPEF, TA 및 SRS 기술의 세부 사항을 시연하는 것을 목표로 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 SF-TRU 모듈과 초고속 이중 출력 레이저 시스템의 조합이 다중 모드 미세 분광법에 대한 응용 분야를 입증했음을 제시했습니다. 암세포의 금 나노입자(AuNP) 흡수를 조사할 수 있는 능력을 갖춘 멀티모달 이미징 플랫폼은 레이저 빔이 AuNP에 흡수될 때 온열암 치료에 대한 세포 반응을 시각화할 수 있습니다.
또한 두 세트의 격자 쌍을 사용하여 각 레이저 빔의 처프를 제…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 EPSRC 보조금 : Raman Notheranostics (EP / R020965 / 1) 및 CONTRAST 시설 (EP / S009957 / 1)의 지원을 받았습니다.
Materials
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| FV3000 | Olympus | IX83P2ZF | Other microscope frames can be used. |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
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