Imagerie biomoléculaire de l’absorption cellulaire de nanoparticules à l’aide de la microscopie optique multimodale non linéaire
Summary
Cet article présente l’intégration d’un module de focalisation spectrale et d’un laser à impulsions à double sortie, permettant une imagerie hyperspectrale rapide des nanoparticules d’or et des cellules cancéreuses. Ce travail vise à démontrer les détails des techniques optiques non linéaires multimodales sur un microscope à balayage laser standard.
Abstract
Il est essentiel de sonder les nanoparticules d’or (AuNP) dans les systèmes vivants pour révéler l’interaction entre les AuNP et les tissus biologiques. De plus, en intégrant des signaux optiques non linéaires tels que la diffusion Raman stimulée (SRS), la fluorescence excitée à deux photons (TPEF) et l’absorption transitoire (TA) dans une plate-forme d’imagerie, il peut être utilisé pour révéler le contraste biomoléculaire des structures cellulaires et des AuNP de manière multimodale. Cet article présente une microscopie optique multimodale non linéaire et l’applique pour effectuer une imagerie chimiquement spécifique des AuNP dans les cellules cancéreuses. Cette plate-forme d’imagerie fournit une nouvelle approche pour développer des AuNP fonctionnalisés plus efficaces et déterminer s’ils se trouvent dans les systèmes vasculaires entourant les espaces tumoraux, péricellulaires ou cellulaires.
Introduction
Les nanoparticules d’or (AuNP) ont montré un grand potentiel en tant que sondes d’imagerie biocompatibles, par exemple, en tant que substrats efficaces de spectroscopie Raman améliorée en surface (SERS) dans diverses applications biomédicales. Les principales applications comprennent des domaines tels que la biodétection, la bioimagerie, les spectroscopies améliorées en surface et la thérapie photothermique pour le traitement du cancer1. En outre, l’étude des AuNP dans les systèmes vivants est cruciale pour évaluer et comprendre l’interaction entre les AuNP et les systèmes biologiques. Il existe diverses techniques analytiques, y compris la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)2, la spectrométrie de masse à couplage inductif par ablation laser (LA-ICP-MS)3 et l’imagerie par résonance magnétique (IRM)4 qui ont été utilisées avec succès pour étudier la distribution des AuNP dans les tissus. Néanmoins, ces méthodes présentent plusieurs inconvénients tels que le fait d’être chronophages et impliquant une préparation d’échantillons complexe3, nécessitant de longs temps d’acquisition, ou l’absence de résolution spatiale submicronique 2,4.
Par rapport aux techniques d’imagerie conventionnelles, la microscopie optique non linéaire offre plusieurs avantages pour sonder les cellules vivantes et les AuNP : La microscopie optique non linéaire atteint une profondeur d’imagerie plus profonde et offre une capacité intrinsèque de section optique 3D avec l’utilisation de lasers ultrarapides proches de l’IR. Grâce à l’amélioration significative de la vitesse d’imagerie et de la sensibilité de détection, il a été démontré que la fluorescence excitée à deux photons (TPEF)5,6,7 et la microscopie de deuxième génération harmonique (SHG)8,9,10 améliorent encore l’imagerie non invasive des biomolécules endogènes dans les cellules et les tissus vivants. De plus, en utilisant de nouvelles techniques optiques non linéaires pompe-sonde telles que l’absorption transitoire (TA)11,12,13,14 et la diffusion Raman stimulée (SRS)15,16,17,18, il est possible d’obtenir un contraste biochimique sans marquage des structures cellulaires et des AuNP. La visualisation des AuNP sans l’utilisation d’étiquettes extrinsèques est d’une grande importance car les perturbations chimiques des nanoparticules modifieront leurs propriétés physiques et donc leur absorption dans les cellules.
Ce protocole présente la mise en œuvre d’un module SF-TRU (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) pour un laser à impulsions à double longueur d’onde, permettant une imagerie multimodale rapide des AuNP et des cellules cancéreuses. Ce travail vise à démontrer les détails des techniques intégrées TPEF, TA et SRS sur un microscope à balayage laser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude a présenté la combinaison du module SF-TRU et du système laser ultrarapide à double sortie démontrée ses applications pour la microspectroscopie multimodale. Grâce à sa capacité à étudier l’absorption des nanoparticules d’or (AuNPs) par les cellules cancéreuses, la plateforme d’imagerie multimodale peut visualiser les réponses cellulaires aux traitements hyperthermiques du cancer lorsque les faisceaux laser sont absorbés par les AuNP.
De plus, une imagerie chim…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par des subventions EPSRC : Raman Nanotheranostics (EP/R020965/1) et CONTRAST facility (EP/S009957/1).
Materials
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| FV3000 | Olympus | IX83P2ZF | Other microscope frames can be used. |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
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