Biomolekulare Bildgebung der zellulären Aufnahme von Nanopartikeln mittels multimodaler nichtlinearer optischer Mikroskopie
Summary
Dieser Artikel stellt die Integration eines spektralfokussierenden Moduls und eines Dual-Output-Pulslasers vor, der eine schnelle hyperspektrale Bildgebung von Goldnanopartikeln und Krebszellen ermöglicht. Diese Arbeit zielt darauf ab, die Details multimodaler nichtlinearer optischer Techniken auf einem Standard-Laserscanning-Mikroskop zu demonstrieren.
Abstract
Die Untersuchung von Goldnanopartikeln (AuNPs) in lebenden Systemen ist unerlässlich, um die Wechselwirkung zwischen AuNPs und biologischem Gewebe aufzudecken. Darüber hinaus kann es durch die Integration nichtlinearer optischer Signale wie stimulierte Raman-Streuung (SRS), Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenz (TPEF) und transiente Absorption (TA) in eine Bildgebungsplattform verwendet werden, um biomolekularen Kontrast von Zellstrukturen und AuNPs multimodal aufzudecken. Dieser Artikel stellt eine multimodale nichtlineare optische Mikroskopie vor und wendet sie an, um chemisch spezifische Bildgebung von AuNPs in Krebszellen durchzuführen. Diese Bildgebungsplattform bietet einen neuartigen Ansatz zur Entwicklung effizienterer funktionalisierter AuNPs und zur Bestimmung, ob sie sich innerhalb von Gefäßen befinden, die den Tumor umgeben, perizellulär oder zellulär.
Introduction
Goldnanopartikel (AuNPs) haben großes Potenzial als biokompatible Bildgebungssonden gezeigt, beispielsweise als effektive oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS)-Substrate in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen. Zu den wichtigsten Anwendungen gehören Bereiche wie Biosensorik, Bioimaging, oberflächenverstärkte Spektroskopien und photothermische Therapie zur Krebsbehandlung1. Darüber hinaus ist die Untersuchung von AuNPs in lebenden Systemen entscheidend für die Bewertung und das Verständnis der Interaktion zwischen AuNPs und biologischen Systemen. Es gibt verschiedene analytische Techniken, darunter die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR)2, die Laserablations-Massenspektrometrie (LA-ICP-MS)3 und die Magnetresonanztomographie (MRT)4, die erfolgreich eingesetzt wurden, um die Verteilung von AuNPs in Geweben zu untersuchen. Dennoch weisen diese Methoden mehrere Nachteile auf, wie z. B. Zeitaufwand und komplexe Probenvorbereitung3, lange Erfassungszeiten oder fehlende räumliche Auflösung im Submikrometerbereich 2,4.
Im Vergleich zu herkömmlichen bildgebenden Verfahren bietet die nichtlineare optische Mikroskopie mehrere Vorteile für die Untersuchung lebender Zellen und AuNPs: Die nichtlineare optische Mikroskopie erreicht eine tiefere Abbildungstiefe und bietet intrinsische optische 3D-Schnittfähigkeit durch den Einsatz von Nah-IR-Ultrakurzpulslasern. Mit der signifikanten Verbesserung der Bildgebungsgeschwindigkeit und Detektionsempfindlichkeit wurde gezeigt, dass die Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenz (TPEF)5,6,7 und die zweite harmonische Generation (SHG)8,9,10-Mikroskopie die nicht-invasive Bildgebung endogener Biomoleküle in lebenden Zellen und Geweben weiter verbessern. Darüber hinaus ist es unter Verwendung neuartiger nichtlinearer optischer Pump-Probe-Techniken wie der transienten Absorption (TA)11,12,13,14 und der stimulierten Raman-Streuung (SRS)15,16,17,18 möglich, markierungsfreien biochemischen Kontrast von Zellstrukturen und AuNPs abzuleiten. Die Visualisierung von AuNPs ohne die Verwendung von extrinsischen Markierungen ist von großer Bedeutung, da chemische Störungen der Nanopartikel ihre physikalischen Eigenschaften und damit ihre Aufnahme in Zellen verändern.
Dieses Protokoll stellt die Implementierung eines SF-TRU-Moduls (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) für einen Zweiwellenlängen-Pulslaser dar, das eine schnelle multimodale Bildgebung von AuNPs und Krebszellen ermöglicht. Diese Arbeit zielt darauf ab, die Details der integrierten TPEF-, TA- und SRS-Techniken auf einem Laserscanning-Mikroskop zu demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie hat die Kombination aus SF-TRU-Modul und ultraschnellem Dual-Output-Lasersystem vorgestellt und ihre Anwendungen für die multimodale Mikrospektroskopie demonstriert. Mit ihrer Fähigkeit, die Aufnahme von Goldnanopartikeln (AuNPs) durch Krebszellen zu untersuchen, kann die multimodale Bildgebungsplattform die zellulären Reaktionen auf hyperthermische Krebsbehandlungen visualisieren, wenn Laserstrahlen von AuNPs absorbiert werden.
Darüber hinaus werden schnelle chemisch spezifis…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch EPSRC Grants unterstützt: Raman Nanotheranostics (EP/R020965/1) und CONTRAST facility (EP/S009957/1).
Materials
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| FV3000 | Olympus | IX83P2ZF | Other microscope frames can be used. |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
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