Imaging biomolecolare dell'assorbimento cellulare di nanoparticelle mediante microscopia ottica non lineare multimodale
Summary
Questo articolo presenta l’integrazione di un modulo di messa a fuoco spettrale e di un laser a impulsi a doppia uscita, che consente una rapida imaging iperspettrale di nanoparticelle d’oro e cellule tumorali. Questo lavoro mira a dimostrare i dettagli delle tecniche ottiche non lineari multimodali su un microscopio a scansione laser standard.
Abstract
Sondare le nanoparticelle d’oro (AuNP) nei sistemi viventi è essenziale per rivelare l’interazione tra AuNP e tessuti biologici. Inoltre, integrando segnali ottici non lineari come lo scattering Raman stimolato (SRS), la fluorescenza eccitata a due fotoni (TPEF) e l’assorbimento transitorio (TA) in una piattaforma di imaging, può essere utilizzato per rivelare il contrasto biomolecolare delle strutture cellulari e delle AuNP in modo multimodale. Questo articolo presenta una microscopia ottica non lineare multimodale e la applica per eseguire immagini chimicamente specifiche di AuNP nelle cellule tumorali. Questa piattaforma di imaging fornisce un nuovo approccio per sviluppare AuNP funzionalizzate più efficienti e determinare se si trovano all’interno di vascolarature che circondano il tumore, gli spazi pericellulari o cellulari.
Introduction
Le nanoparticelle d’oro (AuNP) hanno mostrato un grande potenziale come sonde di imaging biocompatibili, ad esempio, come substrati efficaci della spettroscopia Raman potenziata dalla superficie (SERS) in varie applicazioni biomediche. Le principali applicazioni includono campi come il biorilevamento, il bioimaging, le spettroscopie potenziate dalla superficie e la terapia fototermica per il trattamento del cancro1. Inoltre, sondare le AuNP nei sistemi viventi è fondamentale per valutare e comprendere l’interazione tra AuNP e sistemi biologici. Esistono varie tecniche analitiche, tra cui la spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier(FTIR) 2, la spettrometria di massa accoppiata induttivamente per ablazione laser (LA-ICP-MS)3 e la risonanza magnetica (MRI)4 che sono state utilizzate con successo per studiare la distribuzione delle AuNP nei tessuti. Tuttavia, questi metodi soffrono di diversi inconvenienti, come il tempo richiesto e la preparazione di campioni complessi3, che richiedono lunghi tempi di acquisizione o la mancanza di una risoluzione spaziale inferiore al micron 2,4.
Rispetto alle tecniche di imaging convenzionali, la microscopia ottica non lineare offre diversi vantaggi per sondare cellule vive e AuNP: la microscopia ottica non lineare raggiunge una profondità di imaging più profonda e fornisce funzionalità di sezionamento ottico 3D intrinseco con l’uso di laser ultraveloci vicino all’IR. Con il significativo miglioramento della velocità di imaging e della sensibilità di rilevamento, è stata dimostrata la microscopia a fluorescenza eccitata a due fotoni (TPEF)5,6,7 e la microscopia di seconda generazione armonica (SHG)8,9,10 per migliorare ulteriormente l’imaging non invasivo delle biomolecole endogene nelle cellule e nei tessuti viventi. Inoltre, utilizzando nuove tecniche ottiche non lineari pompa-sonda come l’assorbimento transitorio (TA)11,12,13,14 e lo scattering Raman stimolato (SRS)15,16,17,18, è possibile derivare il contrasto biochimico label-free delle strutture cellulari e delle AuNP. La visualizzazione di AuNP senza l’uso di etichette estrinseche è di grande importanza poiché le perturbazioni chimiche delle nanoparticelle modificheranno le loro proprietà fisiche e quindi il loro assorbimento nelle cellule.
Questo protocollo presenta l’implementazione di un modulo SF-TRU (Spectral Focusing Timing and Recombination Unit) per un laser a impulsi a doppia lunghezza d’onda, che consente l’imaging multimodale rapido di AuNP e cellule tumorali. Questo lavoro mira a dimostrare i dettagli delle tecniche integrate TPEF, TA e SRS su un microscopio a scansione laser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio ha presentato la combinazione del modulo SF-TRU e del sistema laser ultraveloce a doppia uscita che ha dimostrato le sue applicazioni per la microspettroscopia multimodale. Con la sua capacità di studiare l’assorbimento delle nanoparticelle d’oro (AuNP) da parte delle cellule tumorali, la piattaforma di imaging multimodale può visualizzare le risposte cellulari ai trattamenti antitumorali ipertermici quando i raggi laser vengono assorbiti dagli AuNP.
Inoltre, l’imaging rapido c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP/R020965/1) e CONTRAST facility (EP/S009957/1).
Materials
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| FV3000 | Olympus | IX83P2ZF | Other microscope frames can be used. |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
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