Multimodal Doğrusal Olmayan Optik Mikroskopi Kullanılarak Nanopartiküllerin Hücresel Alımının Biyomoleküler Görüntülenmesi
Summary
Bu makalede, altın nanopartiküllerin ve kanser hücrelerinin hızlı hiperspektral görüntülenmesini sağlayan spektral odaklama modülü ve çift çıkışlı darbe lazerinin entegrasyonu sunulmaktadır. Bu çalışma, multimodal doğrusal olmayan optik tekniklerin ayrıntılarını standart bir lazer tarama mikroskobu üzerinde göstermeyi amaçlamaktadır.
Abstract
Canlı sistemlerde altın nanopartiküllerin (AuNP’ler) araştırılması, AuNP’ler ve biyolojik dokular arasındaki etkileşimi ortaya çıkarmak için gereklidir. Ayrıca, uyarılmış Raman saçılması (SRS), iki foton uyarılmış floresan (TPEF) ve geçici absorpsiyon (TA) gibi doğrusal olmayan optik sinyalleri bir görüntüleme platformuna entegre ederek, hücresel yapıların ve AuNP’lerin biyomoleküler kontrastını multimodal bir şekilde ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bu makalede multimodal doğrusal olmayan optik mikroskopi sunulmakta ve kanser hücrelerinde AuNP’lerin kimyasal olarak spesifik görüntülenmesini gerçekleştirmek için uygulanmaktadır. Bu görüntüleme platformu, daha verimli işlevselleştirilmiş AuNP’ler geliştirmek ve tümörü, perisellüler veya hücresel alanları çevreleyen vaskülatürler içinde olup olmadıklarını belirlemek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.
Introduction
Altın nanopartiküller (AuNP’ler), biyouyumlu görüntüleme probları olarak, örneğin çeşitli biyomedikal uygulamalarda etkili yüzey geliştirilmiş Raman spektroskopisi (SERS) substratları olarak büyük potansiyel göstermiştir. Başlıca uygulamalar arasında biyoalgılama, biyogörüntüleme, yüzey geliştirilmiş spektroskopiler ve kanser tedavisi için fototermal tedavi gibi alanlarbulunmaktadır 1. Ayrıca, canlı sistemlerdeki AuNP’lerin araştırılması, AuNP’ler ve biyolojik sistemler arasındaki etkileşimi değerlendirmek ve anlamak için çok önemlidir. AuNP’lerin dokulardaki dağılımını araştırmak için başarıyla kullanılan Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi2, lazer ablasyon endüktif olarak eşleşmiş kütle spektrometresi (LA-ICP-MS)3 ve manyetik rezonans görüntüleme (MRI)4 dahil olmak üzere çeşitli analitik teknikler vardır. Bununla birlikte, bu yöntemler zaman alıcı olmak ve karmaşık numune hazırlama3’ü içeren, uzun edinme süreleri gerektiren veya mikronun altındaki uzamsal çözünürlük 2,4’ün eksikliği gibi çeşitli dezavantajlardan muzdariptir.
Geleneksel görüntüleme teknikleriyle karşılaştırıldığında, doğrusal olmayan optik mikroskopi, canlı hücrelerin ve AuNP’lerin araştırılması için çeşitli avantajlar sunar: Doğrusal olmayan optik mikroskopi, daha derin görüntüleme derinliği elde eder ve IR’ye yakın ultra hızlı lazerlerin kullanımıyla içsel 3D optik kesitleme yeteneği sağlar. Görüntüleme hızının ve algılama duyarlılığının önemli ölçüde artmasıyla, iki foton uyarılmış floresan (TPEF) 5,6,7 ve ikinci harmonik jenerasyon (SHG) 8,9,10 mikroskopisinin canlı hücrelerde ve dokularda endojen biyomoleküllerin non-invaziv görüntülemesini daha da geliştirdiği gösterilmiştir. Ayrıca, geçici absorpsiyon (TA)11,12,13,14 ve uyarılmış Raman saçılması (SRS)15,16,17,18 gibi yeni pompa-prob doğrusal olmayan optik teknikleri kullanarak, hücresel yapıların ve AuNP’lerin etiketsiz biyokimyasal kontrastını elde etmek mümkündür. AuNP’leri dışsal etiketler kullanmadan görselleştirmek büyük önem taşımaktadır, çünkü nanopartiküllerin kimyasal pertürbasyonları fiziksel özelliklerini ve dolayısıyla hücrelerdeki alımlarını değiştirecektir.
Bu protokol, çift dalga boylu darbeli bir lazer için bir Spektral Odaklama Zamanlama ve Rekombinasyon Birimi (SF-TRU) modülünün uygulanmasını sunarak, AuNP’lerin ve kanser hücrelerinin hızlı multimodal görüntülemesini sağlar. Bu çalışma, entegre TPEF, TA ve SRS tekniklerinin ayrıntılarını bir lazer tarama mikroskobu üzerinde göstermeyi amaçlamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada SF-TRU modülü ve ultra hızlı çift çıkışlı lazer sisteminin kombinasyonu sunulmuş ve multimodal mikrospektroskopi için uygulamaları gösterilmiştir. Altın nanopartiküllerin (AuNP’ler) kanser hücreleri tarafından alımını araştırma yeteneği ile multimodal görüntüleme platformu, lazer ışınları AuNP’ler tarafından emildiğinde hipertermik kanser tedavilerine hücresel yanıtları görselleştirebilir.
Ayrıca, hızlı kimyasal olarak spesifik görünt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP / R020965 / 1) ve CONTRAST tesisi (EP / S009957 / 1) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| APE SRS Detection Unit | APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH) | APE Lock-in Module | Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations |
| Confocal Scanning Unit | Olympus | FV 3000 | Confocal scanning unit used for imaging |
| CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm | Invitrogen | C37483 | Polystyrene microspheres |
| Coverslips | Thorlabs | CG15CH2 | 22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells |
| FBS | Gibco | 10500-064 | Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated) |
| Flouview | Olympus | FV31S-SW | Laser scanning microscope control software |
| Function Generator | BX precision | 40543 | Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam |
| FV3000 | Olympus | IX83P2ZF | Other microscope frames can be used. |
| Gold Nanoparticles | Nanopartz | A11-60 | Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter |
| Input Output Interface | Olympus | FV30 ANALOG | This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit. |
| InSight X3 | Newport | Spectra-Physics | Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz. |
| Microscope Frame | Olympus | IX83 | Inverted microscope |
| Mouse 4T1 cells | ATCC | CRL-2539 | Mouse breast cancer cells |
| NA 1.2 Water Immersion Objective | Olympus | UPLSAPO60XW/IR | The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used. |
| NA 1.4 Condenser | Nikon | CSC1003 | Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used. |
| PMT | Hamamatsu | R3896 | PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy |
| PMT Connector | Hamamatsu | C13654-01-Y002 | Connector for PMT |
| Power Supply | RS | RSPD-3303 C | Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT |
| RPMI-1640 | Gibco | A10491-01 | Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells. |
| SF-TRU | Newport Spectra Physics | SF-TRU | System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS |
References
- Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), 1903441 (2020).
- Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
- Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
- Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), 5049-5056 (2015).
- Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), 1801735 (2019).
- Wang, C. -. C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).
- Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
- Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
- Wang, C. -. C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).
- Li, F. -. C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
- Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
- Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
- Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
- Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Wang, C. -. C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).
- Wang, C. -. C., Yoong, F. -. Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).
- Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
- Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).
- Wang, C. -. C., Wu, R. -. J., Lin, S. -. J., Chen, Y. -. F., Dong, C. -. Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).
- Wang, C. -. C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).
- Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
- Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).
