Évaluation de la probabilité ouverte du pore de transition de perméabilité mitochondriale dans le cadre de l’excès de coenzyme Q

Résumé

Cette méthode exploite la contribution du pore de transition de perméabilité mitochondriale à la fuite de protons à faible conductance pour déterminer le seuil de tension pour l’ouverture des pores chez les souris atteintes du syndrome de l’X fragile néonatal avec une teneur accrue en coenzyme Q mitochondriale cardiomyocytaire par rapport au contrôle wildtype.

Résumé

Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) est un méga-canal de membrane mitochondriale interne (IMM) voltage-dépendant, non sélectif et important pour la santé et la maladie. Le mPTP médie la fuite de protons à travers l’IMM lors de l’ouverture à faible conductance et est spécifiquement inhibé par la cyclosporine A (CsA). La coenzyme Q (CoQ) est un régulateur de la mPTP, et des différences spécifiques aux tissus ont été trouvées dans la teneur en CoQ et la probabilité ouverte de la mPTP dans le cerveau antérieur et les mitochondries cardiaques dans un modèle murin nouveau-né du syndrome de l’X fragile (FXS, Fmr1 knockout). Nous avons développé une technique pour déterminer le seuil de tension pour l’ouverture mPTP dans cette souche mutante, en exploitant le rôle du mPTP en tant que canal de fuite de protons.

Pour ce faire, la consommation d’oxygène et le potentiel membranaire (ΔΨ) ont été mesurés simultanément dans des mitochondries isolées à l’aide de la polarographie et d’une électrode sélective d’ions tétraphénylphosphonium (TPP⁺) pendant la respiration des fuites. Le seuil d’ouverture du mPTP a été déterminé par l’apparition d’une inhibition médiée par la CsA de la fuite de protons à des potentiels membranaires spécifiques. En utilisant cette approche, les différences de tension gating du mPTP ont été définies avec précision dans le contexte de l’excès de CoQ. Cette nouvelle technique permettra d’étudier à l’avenir la compréhension de la régulation physiologique et pathologique de l’ouverture à faible conductance du mPTP.

Introduction

Le mPTP médie la transition de perméabilité (PT), par laquelle l’IMM devient brusquement perméable aux petites molécules et solutés ^1,2. Ce phénomène frappant s’écarte nettement de l’imperméabilité caractéristique de l’IMM, qui est fondamentale pour établir le gradient électrochimique nécessaire à la phosphorylation oxydative³. La PT, contrairement à d’autres mécanismes de transport mitochondrial, est un processus à haute conductance, non spécifique et non sélectif, permettant le passage d’une gamme de molécules jusqu’à 1,5 kDa ^4,5

Protocole

L’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Columbia University Medical Center a été obtenue pour toutes les méthodes décrites. Les souris FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b⁺ Tyr^c-ch Fmr1^tm1Cgr/J) et de contrôle (FVB) (FVB.129P2-Pde6b⁺ Tyr^c-ch/AntJ) utilisées comme systèmes modèles pour cette étude ont été acquises commercialement (voir la Table des matériaux). Cinq à onze animaux ont été utilisés dans chaque groupe expérimental. Des souris postnatales de jour 10 (P10) ont été utilisées pour modéliser un point temporel dans la petite enfance humaine.

Résultats

La consommation typique d’O2 et les courbes ΔΨ générées dans ces expériences sont montrées (Figure 1A,B). La baisse logarithmique du signal de tension avec l’étalonnage TPP⁺ est montrée au début de chaque expérience. L’absence de ce schéma logarithmique peut suggérer un problème avec l’électrode ^sélective TPP+. Les mitochondries génèrent généralement ΔΨ immédiatement après l’ajout au tampon respiratoire. ΔΨ peut être interprété à partir des c.......

Discussion

Cet article décrit une méthode pour évaluer la probabilité d’ouverture du mPTP. Plus précisément, le seuil de tension pour l’ouverture mPTP à faible conductance a été déterminé en évaluant l’effet de l’inhibition de CsA sur la fuite de protons sur une plage de ΔΨs. En utilisant cette technique, nous avons pu identifier des différences dans la grille de tension du mPTP entre les souris FXS et les contrôles FVB compatibles avec leurs différences dans la teneur en CoQ spécifique des tissus. Un élément essentiel au succès de.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthananesulfonique (HEPES)	Fisher Scientific	15630080
Ensemble de piston adapté pour les électrodes sélectives de pH ou d’ions à utiliser avec les systèmes OXYT1	PP	941039
les tubes BD Intramedic PE, PE 50, 0,023 po 10 pi	Fisher Scientific	14-170-11B	pour modifier la longueur de la synringe de Hamilton au besoin
Albumine sérique bovine (BSA). Électrode	Sigma	A7030-10G
, 2 mm	World Precision Inst. LLC	DRIREF-2
Porte-électrode pour KWIK-Tips	World Precision Inst. LLC	KWIK-2	; Porte-électrode sélectif ionique
Ethylène glycol-bis(&beta ;-aminoéthyl éther)-N,N,N&prime ;,N&prime ;-acide tétraacétique  ; (EGTA)	Sigma	324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		Souris FXS, Fmr1 KO  ;
FVB.129P2-PDE6b+ Tyrc-ch/AntJ	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME		Souris FVB
Hamilton 80366 Seringues standard, 10 uL, aiguille cimentée, 6/pqt	Cole-Parmer	EW-07938-30	Microseringue
Hamilton 80500 Seringues standard de microlitre, 50 uL, aiguille cémentée	Cole-Parmer	EW-07938-02	microseringue
Hansatech Instruments Système Oxytherm+ (Respiration)	Systèmes PP	Électrode d’oxygène	OXYTHERM+R
Chlorure de magnésium (MgCl2)	Sigma	1374248
Mannitol	Sigma	M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5&prime ; pentaphosphate pentasodique (AP5A)	Sigma	D4022-10MG
Percoll	Milieu Sigma	P1644	pour la séparation par gradient de densité
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma	P3911
Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4)	Sigma	5.43841
Saccharose	Sigma	S0389
TPP+ Embouts d’électrodes (3)	World Precision Inst. LLC	TIPTPP

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