演示了一种高速开顶紫外光声显微镜,可以在术中为手术边缘分析提供组织学图像,包括系统配置,光学对准,样品制备和实验程序。
手术切缘分析(SMA)是确认肿瘤切除手术中癌组织完全切除的必要程序,需要术中诊断工具,以避免由于手术切缘阳性而重复手术。最近,利用266 nm波长下DNA/RNA的高固有光学吸收,紫外光声显微镜(UV-PAM)被开发出来,以提供高分辨率的组织学图像,无需标记,显示出作为SMA术中工具的巨大前景。为了能够开发用于SMA的UV-PAM,这里提出了一种高速开顶UV-PAM系统,其操作方式类似于传统的光学显微镜。UV-PAM 系统通过单轴振镜扫描提供 1.2 μm 的高横向分辨率和 55 kHz A 线速率的高成像速度。此外,为了确保病理学家无需额外培训即可轻松解释UV-PAM图像,原始灰度UV-PAM图像通过深度学习算法进行虚拟染色,以模拟标准苏木精和曙红染色图像,从而实现免培训的组织学分析。进行小鼠脑切片成像以证明开顶UV-PAM系统的高性能,说明其在SMA应用中的巨大潜力。
手术切缘分析(SMA)需要在显微镜下检查组织标本,是确定切除手术中是否从患者体内取出所有癌细胞的基本程序1。因此,能够快速提供组织学图像的显微镜对于SMA至关重要,可以避免因不完全切除癌细胞而引起的重复手术。然而,根据目前基于明场光学显微镜的金标准方法,切除的组织需要固定在福尔马林中,嵌入石蜡中,切片成薄片(4-7μm),然后在成像前用苏木精和曙红(H&E)染色,这很耗时(3-7天)且费力2,3.冷冻切片是SMA的快速替代方法,通过快速冷冻,切片和染色组织,可以在20-30分钟内提供组织学图像4。然而,组织学特征经常被扭曲,需要熟练的训练,这阻碍了该技术对多种类型的器官的适用性5。
已经为SMA开发了可以提供细胞图像的光学显微镜技术,而无需或只需几个组织处理步骤。但是,他们每个人都有不同的问题。例如,光学相干断层扫描6 和共聚焦反射显微镜7 由于其固有的散射对比度低而具有低特异性。虽然具有紫外线表面激发8 和光片显微镜9 的显微镜可以为SMA提供高分辨率和高对比度的图像,但毒性和挥发性染色程序通常不能在手术室中进行,这延长了周转时间。多光子显微镜10 和受激拉曼显微镜11 可以为SMA提供丰富的信息。然而,用于产生非线性效应所需的超快激光器的高成本阻碍了它们的广泛适用性。
最近,通过利用固有的光学吸收,已经开发了无标记紫外光声显微镜(UV-PAM)来提供高分辨率组织学图像12。在UV-PAM中,激发UV光的光子能量(例如,266nm)首先被细胞核13 中的DNA / RNA吸收,然后转化为热量,通过热弹性膨胀14诱导声波发射。通过检测产生的声波, 可以通过 声学信号的最大振幅投影获得细胞核的二维(2D)UV-PAM图像,从而为SMA提供组织学信息。为了实现UV-PAM的临床应用,已经开发了基于振镜扫描的高速UV-PAM,可在18分钟内为脑活检样本(5 mm x 5 mm)提供组织学图像,在时间敏感型应用中显示出巨大的潜力15.为了进一步验证UV-PAM在厚组织成像中的可能性,提出了一种带有防水单轴微机电系统扫描仪的反射模式UV-PAM系统,成功地证明了术中对人结肠和肝脏组织的组织病理学检查16。由于原始UV-PAM图像是灰度的,而黄金标准的H&E染色图像是粉红色和紫色的,病理学家很难直接解释UV-PAM图像。为了解决这个问题,提出了一种深度学习算法,将灰度UV-PAM图像近乎实时地转移到虚拟H&E染色图像中,以便病理学家无需任何额外培训即可理解图像17。
这项工作报告了一种高速开顶UV-PAM系统,该系统可以像传统的光学显微镜一样操作,提供原始的灰度组织学图像和由深度学习算法辅助的虚拟染色图像。UV-PAM系统对福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)小鼠脑切片进行成像,以证明我们几乎染色的UV-PAM与标准H&E染色图像之间的相似性,显示了其在SMA应用中的潜力。
综上所述,一种高速开顶UV-PAM系统已被证明可用于组织学成像。介绍了有关系统配置、光学对准、样品制备和实验程序的详细说明。可以通过材料表中提供的链接从Github访问图像采集程序。本系统的横向分辨率约为1.2μm,在最近的出版物21中进行了实验测量。对小鼠脑切片进行成像,以证明本系统可以在18分钟内获得面积为5 x 5 mm2的组织学图像,这是典型大小的脑活检22。虽然原始图像是灰度的,但在深度学习算法启用的数字虚拟染色工具的帮助下,目前的系统可以进一步提供近乎实时的虚拟染色图像,确保病理学家易于适应以解释图像。作为一种无标记图像技术,本UV-PAM系统还可以为未处理的新鲜组织样品提供组织学图像。更多的实例(包括冷冻切片和新鲜组织样品)已经在以前的出版物17中得到了证实。实验结果表明,目前深度学习辅助UV-PAM系统在SMA应用中具有较高的应用潜力。
UV-PAM系统的优点之一是该系统在反射模式下实现,能够对厚组织进行成像。此外,开顶UV-PAM系统允许将样品放置在扫描窗口(样品罐的膜)上,其操作与传统光学显微镜类似。因此,该系统比其它要求样品被两个膜11,14夹在中间的系统更加用户友好。此外,通过使用具有高重复率紫外激光器的1D GM,与使用多焦点激发23的系统相比,目前的UV-PAM系统可以实现高成像速度和更高的成本效益。
目前,成像速度主要受激光重复率和光子预算的限制。使用具有高重复率和高脉冲能量的激光器,可以进一步缩短成像时间。该系统的另一个局限性是,通过找到最大PA信号,样品只能粗略地调整到物镜的焦平面,而不是显示实时图像供用户可视化样品是否对焦。要显示近乎实时的图像,可以应用2D GM。
协议中有两个关键步骤:(a)应优化光学和声学焦点的共聚焦要求,以实现高检测灵敏度;(b)GM在x轴上的扫描范围应小于环形UT的声学焦点,以保持类似的高检测灵敏度(在当前设置中,扫描范围约为30μm±15μm)。否则,将多个子图像拼接在一起以获得整个图像时,边缘周围会出现明显的暗角效果。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢香港创新科技署的资助(ITS/036/19)。
Alcohol | Sigma Aldrich | PHR1373 | Sample dehydration |
Amplifier | Mini Circuit | ZFL-500LN-BNC+ | Ultrasonic signal amplification |
Controller | National Instruments | NI myRIO | System controller |
Data acquisition card | Alazar Technologies | ATS9350 | Ultrasonic signal collection |
Deep-learning algorithm | For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM | ||
Formalin | Sigma Aldrich | R04586 | Sample fixation |
H&E staining kit | Abcam | ab245880 | Sample staining |
Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | Sample deparaffinization |
Image acquisition program | National Instruments | LabVIEW | Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM |
Image processing algorithm | Mathworks | MATLAB | Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM |
Kinematic platform mounts | Thorlabs | KM200B | Adjust the sample to be flat |
Membrane | Glad | Cling wrap | Sandwiched in sample tank |
Microscope objective lens | Thorlabs | LMU- 5X-NUV | Objective lens |
Motorized stages | Physik Instrumente | L-509.10SD00 | Scanning stages |
One-dimensional galvanometer mirror | Thorlabs | GVS411 | Fast scanning mirror |
Oscilloscope | RIGOL Technologies | DS1102E | Ultrasonic signal readout |
Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P3813 | Sample washing |
Pinhole | Edmund Optics | #59–257 | Spatial filtering |
Plano convex lens | Thorlabs | LA-4600-UV | Focusing lens |
Plano convex lens | Thorlabs | LA-4663-UV | Collimating lens |
Pulser/receiver | Imaginant | DPR300 | Pulse echo amplifier |
Q-switch diode-pumped solid-state laser | Bright Solutions | WEDGE HF 266 nm | 266-nm laser |
Ring-shaped ultrasonic transducer | University of Southern California | Ultrasonic signal detection | |
Sample holder | Lab-made | Hold the sample tank | |
Sample tank | Lab-made | Hold biological samples | |
Single-axis Z-translational stage | Thorlabs | PT1 | Manual stage |
Two-axis manual stage | Thorlabs | LX20 | Manual stage |
Water tank | Lab-made | Ultrasonic signal transmission | |
Xylene | Sigma Aldrich | XX0060 | Sample clearing |