مزارع الخلايا الأولية لدراسة إمكانات تجديد مورين مولر غليا بعد علاج الحمض النووي الريبي الميكروي
Summary
تمثل مزارع مولر الدبقية الأولية التي تم الحصول عليها من شبكية العين الفأرية أداة قوية وموثوقة للغاية لدراسة التحويل الدبقي إلى خلايا سلف شبكية العين بعد علاج الحمض النووي الريبي الميكروي. يمكن اختبار جزيئات أو تركيبات مفردة قبل تطبيقها اللاحق للنهج في الجسم الحي .
Abstract
دبقية مولر (MG) هي الدبقية السائدة في شبكية العين العصبية ويمكن أن تعمل كمصدر متجدد للخلايا العصبية الشبكية. في الفقاريات السفلى مثل الأسماك ، يحدث التجديد المدفوع ب MG بشكل طبيعي. ومع ذلك ، في الثدييات ، يلزم التحفيز بعوامل معينة أو التلاعب الوراثي / اللاجيني. نظرا لأن MG لا تشكل سوى 5٪ من عدد خلايا الشبكية ، فهناك حاجة إلى أنظمة نموذجية تسمح بدراسة مجموعة الخلايا هذه حصريا. أحد هذه الأنظمة النموذجية هو مزارع MG الأولية القابلة للتكرار ويمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات ، بما في ذلك فحص وتحديد الجزيئات / العوامل ، واختبار المركبات أو العوامل ، ومراقبة الخلايا ، و / أو الاختبارات الوظيفية. يستخدم هذا النموذج لدراسة إمكانات الفئران MG للتحول إلى خلايا عصبية شبكية العين بعد مكملات أو تثبيط الحمض النووي الريبي الميكروي (miRNAs) عن طريق نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال الاصطناعي أو مثبطاتها. أكد استخدام الفئران الصحفية الخاصة ب MG بالاقتران مع وضع العلامات المناعية الفلورية وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) أن 80٪ -90٪ من الخلايا الموجودة في هذه الثقافات هي MG. باستخدام هذا النموذج ، تم اكتشاف أن miRNAs يمكنها إعادة برمجة MG إلى خلايا سلف شبكية العين (RPCs) ، والتي تتمايز لاحقا إلى خلايا تشبه الخلايا العصبية. مزايا هذه التقنية هي أنه يمكن اختبار مرشحي miRNA لكفاءتهم ونتائجهم قبل استخدامهم في تطبيقات الجسم الحي .
Introduction
دبقية مولر (MG) هي الدبقية السائدة في شبكية العين العصبية. لديهم وظائف مماثلة مقارنة بالدبقية الأخرى في أجزاء أخرى من الجهاز العصبي المركزي مثل الحفاظ على توازن الماء والأيونات ، وتغذية الخلايا العصبية ، وحماية الأنسجة. تتمتع MG بميزة رائعة أخرى: على الرغم من أنها دبقية ناضجة ، إلا أنها لا تزال تعبر عن العديد من الجينات التي يتم التعبير عنها في الخلايا السلفية للشبكية (RPCs) خلال التطور المتأخر 1,2. يفترض أن هذا التشابه هو السبب في التجديد العصبي القائم على MG الذي يحدث بشكل طبيعي في شبكية العين بعد تلف الشبكية 3,4. خلال هذه العملية ، تعيد MG الدخول في دورة الخلية وإلغاء التمايز إلى RPCs التي تتمايز بعد ذلك إلى جميع الأنواع الستة من الخلايا العصبية الشبكية. على الرغم من أن هذه الظاهرة تحدث بشكل طبيعي في الأسماك ، إلا أن الثدييات MG لا تتحول إلى خلايا عصبية 5,6. ومع ذلك، يمكن إعادة برمجتها. وقد ثبت أن مجموعة متنوعة من العوامل تعيد برمجة MG في RPCs / الخلايا العصبية. من بين هذه العوامل عامل النسخ الحلزوني الحلزوني الأساسي (bHLH) المتجانس 1 (Ascl1) الذي يشارك في تجديد الأسماك 7,8. في الفئران ، يتم التعبير عن Ascl1 فقط في RPCs أثناء تكوين الشبكية ولكنه غائب في MG الناضجة أو الخلايا العصبية الشبكية9.
إن إعادة برمجة الخلايا مباشرة في الجسم الحي ليست تحديا منهجيا فحسب ، بل تتطلب أيضا موافقة لجنة مؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها. للحصول على الموافقة ، يلزم الحصول على بيانات أولية حول العامل (العوامل) المستخدمة أو المعدلة ، والتركيزات ، والآثار غير المستهدفة ، والآليات الأساسية ، والسمية ، والكفاءة. تسمح أنظمة زراعة الخلايا باختبار هذه المعايير قبل استخدامها في نماذج الجسم الحي. علاوة على ذلك ، نظرا لأن MG لا تشكل سوى حوالي 5٪ من إجمالي عدد خلايا الشبكية 10 ، فإن مزارع MG تسمح بدراسة وظيفتها11 وكذلك سلوكها ، بما في ذلك الهجرة12,13 ، الانتشار14 ، رد فعل الإجهاد على الإصابة / التلف15,16 ، تفاعلها مع أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الدبقية الصغيرة17 أو خلايا العقدة الشبكية (RGCs)18 ، أو إمكاناتها العصبية19،20،21. يستخدم العديد من الباحثين خطوط الخلايا الخالدة لدراساتهم لأن لديهم إمكانات تكاثرية غير محدودة ويمكن الحفاظ عليها ونقلها بسهولة. ومع ذلك ، فإن الخلايا الأولية أفضل للفحوصات ذات الصلة بيولوجيا من الخلايا المخلدة لأنها تتمتع بخصائص خلية حقيقية (التعبير الجيني والبروتيني) ، والأهم من ذلك ، أنها تمثل مرحلة معينة من التطور وبالتالي لديها “عمر”. يعد عمر الحيوان (وبالتالي الخلايا التي تم الحصول عليها من الحيوان) عاملا حاسما بشكل خاص في إعادة البرمجة الخلوية لأن لدونة الخلية تقل مع تقدم مرحلة التطور22.
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إعادة برمجة MG الأساسي باستخدام miRNAs كطريقة حالية في المختبر لدراسة التجديد. تم إنشاء نموذج الاستزراع الأولي MG هذا في عام 2012 لتقييم خصائص تكاثر الخلايا من MG في الفئران الضربة القاضية P53 (trp53-/- الفئران)23. وقد تبين أن MG المستزرعة تحافظ على ميزاتها الدبقية (أي التعبير عن بروتينات S100β و Pax6 و Sox2 التي تم تقييمها عن طريق وضع العلامات المناعية الفلورية) ، وأنها تشبه في الجسم الحي MG (microarray من MG المنقى FACS)23. بعد ذلك بوقت قصير، تم التحقق من صحة الحمض النووي الريبوزي المرسال الدبقي والتعبير عن البروتين وتأكيدهما في نهج مختلف باستخدام النواقل الفيروسية20. بعد بضع سنوات ، تم التأكيد على أن الغالبية العظمى من الخلايا الموجودة في هذه الثقافات هي MG باستخدام Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl مراسل الفأر24 الخاص ب MG. وعلاوة على ذلك، أظهر التقدير الكمي لمجموعة الحمض النووي الريبوزي المرسال في كل من MG المنقى من قبل FACS-و MG الأولي المستزرع أن مستويات MG miRNAs (mGLiomiRs) لا تختلف كثيرا في MG المستزرعة خلال مرحلة النمو. ومع ذلك ، فإن فترات الاستزراع الممدودة تسبب تغيرات في مستويات miRNA وبالتالي في مستويات mRNA والتعبير عن البروتين لأن miRNAs هي منظمات انتقالية25.
في عام 2013 ، تم استخدام نموذج ثقافة MG هذا لاختبار مجموعة متنوعة من عوامل النسخ فيما يتعلق بقدرتها على إعادة برمجة MG إلى خلايا عصبية شبكية20. تم العثور على Ascl1 ليكون عامل إعادة برمجة قوي جدا وموثوق به. الإفراط في التعبير عن Ascl1 عن طريق النواقل الفيروسية الناجمة عن التغيرات المورفولوجية ، والتعبير عن علامات الخلايا العصبية ، واكتساب الخصائص الكهروفسيولوجية العصبية. والأهم من ذلك، تم نقل الرؤى والنتائج التي تم الحصول عليها من هذه التجارب المختبرية الأولى بنجاح إلى التطبيقات في الجسم الحي22,26 مما يدل على أن مزارع MG الأولية تمثل أداة صلبة وموثوقة لفحص العوامل الأولية وتقييم الميزات الدبقية قبل التنفيذ في الجسم الحي.
قبل بضع سنوات ، تبين أن miRNA miR-124 المخصب بالدماغ ، والذي يتم التعبير عنه أيضا بشكل كبير في الخلايا العصبية الشبكية ، يمكن أن يحفز تعبير Ascl1 في MG21 المستزرعة. تم تصور تعبير Ascl1 في الخلايا الحية عبر ماوس مراسل Ascl1 (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl). فأر المراسل هو فأر مهندس وراثيا يحتوي على جين مراسل مدرج في حمضه النووي. يشفر جين المراسل هذا لبروتين المراسل ، وهو في هذه الدراسة tdTomato، وهو بروتين فلورسنت أحمر. هذا البروتين المراسل تقارير التعبير عن جين من الاهتمام، في هذه الحالة، Ascl1. بمعنى آخر ، ستتحول الخلايا التي تعبر عن Ascl1 إلى اللون الأحمر. نظرا لأن Ascl1 يتم التعبير عنه فقط في RPCs9 ، فإن ماوس Ascl1 CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl يسمح بتتبع تحويل MG إلى Ascl1 يعبر عن RPCs ، مما يعني أن الخلايا المحولة ستعبر عن بروتين مراسل tdTomato الفلورسنت الأحمر. هذا هو وضع العلامات التي لا رجعة فيها منذ تغيير الحمض النووي لهذه الخلايا. وبالتالي ، سيتم تصور أي تمايز عصبي لاحق لأن تسمية tdTomato تبقى في الخلايا المتباينة. إذا كان Ascl1 الذي يعبر عن RPCs المشتقة من MG (مع تسمية tdTomato) يتمايز إلى خلايا عصبية ، فستظل هذه الخلايا العصبية تحمل علامتها الحمراء. وبالتالي ، فإن هذا الماوس لا يسمح فقط بوضع علامات على RPCs المشتقة من MG لتصوير الخلايا الحية ولكن يسمح أيضا برسم خرائط المصير وتتبع النسب لهذه RPCs المشتقة من MG (الحمراء). في الآونة الأخيرة ، تم تحديد مجموعة من miRNAs في RPCs وتم استخدام ثقافات MG من Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reporter الفئران لفحص واختبار تأثير هذه miRNAs على قدرة إعادة البرمجة والكفاءة27. تم العثور على مرشح واحد ، RPC-miRNA miR-25 ، قادر على إعادة برمجة MG المستزرعة في خلايا Ascl1 المعبرة (Ascl1-Tomato+). تعتمد هذه الخلايا المعاد برمجتها ميزات عصبية بمرور الوقت ، بما في ذلك مورفولوجيا الخلايا العصبية (سوماتا صغيرة وإما عمليات دقيقة قصيرة أو طويلة) ، والتعبير عن النسخ العصبية التي تم قياسها عبر scRNA-Seq ، بالإضافة إلى التعبير عن البروتينات العصبية التي تم التحقق منها عبر وضع العلامات المناعيةالفلورية 27.
هنا ، يوضح البروتوكول بالتفصيل كيفية زراعة ونقل MG من الفئران P12 المقتبسة من العمل السابق 21،24،27. تم اختيار miRNA miR-25 المذكور أعلاه لهذا البروتوكول ، وهو miRNA يتم التعبير عنه بشكل كبير في RPCs ، مع انخفاض مستويات التعبير في MG أو الخلايا العصبية الشبكية. من أجل المبالغة في التعبير عن miR-25 ، يحاكي miR-25 الفئران ، أي يتم استخدام جزيئات miRNA الاصطناعية. كعنصر تحكم ، يتم اختيار محاكاة miRNA من Caenorhabditis elegans ، والتي ليس لها وظيفة في خلايا الثدييات. تم إنجاز تصور تحويل MG إلى RPCs عبر ماوس مراسل RPC (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl) ، وهو ماوس ذو خلفية مختلطة (سلالات C57BL/6 و S129 و ICR). ومع ذلك ، يمكن إجراء هذه الثقافة مع جميع سلالات الفئران ، بما في ذلك السلالات البرية. في السنوات القليلة الماضية ، تم تعديل البروتوكول الأصلي لتقليل مدة مرحلة النمو وفترة الثقافة الشاملة وضمان حالة خلايا دبقية أكثر قوة وتقليل درجة التنكس الخلوي ، الذي يحدث في فترات الاستزراع الطويلة. كما تم تمديد النافذة الزمنية العادية للنقل من 3 ساعات إلى 2 أيام. كما ذكرنا من قبل ، على الرغم من أن البروتوكول الحالي يصف ثقافات MG كأداة لدراسات التجديد ، فإن الطريقة ليست مفيدة فقط لاختبار عوامل إعادة البرمجة ، ولكن يمكن أيضا تكييفها لتطبيقات أخرى ، بما في ذلك الدراسات حول السلوك المهاجر أو التكاثري MG ، والنماذج المتعلقة بالإصابة / تلف الخلايا ، و / أو تحديد الآليات والمسارات الأساسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول كيفية نمو MG من شبكية العين الفأرية المنفصلة لإعادة برمجة الدراسات باستخدام miRNAs. كما هو موضح ومؤكد في مجموعة متنوعة من الدراسات السابقة ، فإن الغالبية العظمى (80٪ -90٪) من الخلايا الموجودة في هذه الثقافات هي MG20,23,24. هذه الطر…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتورة آن بيتون وجميع أعضاء المختبر على مدخلاتهم في المخطوطة. نتوجه بشكر خاص إلى الدكاترة توم ريه وجوليا بولاك وروس تايلور على تقديم ثقافات MG الأولية كأداة فحص ل S.G.W. خلال تدريب ما بعد الدكتوراه في جامعة واشنطن في سياتل. تم تمويل الدراسة من خلال منحة برنامج Empire Innovation Program (EIP) إلى S.G.W. وصناديق بدء التشغيل من SUNY Optometry إلى S.G.W. ، بالإضافة إلى جائزة R01EY032532 من المعهد الوطني للعيون (NEI) إلى S.G.W.
Materials
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 |
frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
- Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
- Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
- Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
- Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
- Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
- Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
- Brzezinski, J. A. t., Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
- Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
- Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
- Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
- Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
- Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
- Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
- Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
- Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
- Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
- Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
- Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
- Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
- Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
- Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
- Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
- Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
- Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
- Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
- Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
- Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
- Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
- Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Biologie du développement. 360 (1), 241-255 (2011).
- Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
- Brzezinski, J. A. t., Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
- Brzezinski, J. A. t., Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Biologie du développement. 384 (2), 194-204 (2013).
- Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
- Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
- Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
- VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
- Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
- Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
- Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
- Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
- Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
- Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
- Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
- Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
- Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).
