Primaire celculturen om het regeneratiepotentieel van Murine Müller Glia na microRNA-behandeling te bestuderen

Summary

Müller glia primaire culturen verkregen uit het netvlies van muizen vormen een zeer robuust en betrouwbaar hulpmiddel om de gliale omzetting in retinale voorlopercellen na microRNA-behandeling te bestuderen. Afzonderlijke moleculen of combinaties kunnen worden getest voordat ze vervolgens in vivo worden toegepast.

Abstract

Müller glia (MG) zijn de overheersende glia in het neurale netvlies en kunnen functioneren als een regeneratieve bron voor retinale neuronen. Bij lagere gewervelde dieren zoals vissen vindt MG-gedreven regeneratie van nature plaats; bij zoogdieren is echter stimulatie met bepaalde factoren of genetische/epigenetische manipulatie vereist. Aangezien MG slechts 5% van de retinale celpopulatie uitmaakt, is er behoefte aan modelsystemen die de studie van deze celpopulatie uitsluitend mogelijk maken. Een van deze modelsystemen zijn primaire MG-culturen die reproduceerbaar zijn en kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder moleculen / factorscreening en -identificatie, testen van verbindingen of factoren, celmonitoring en / of functionele tests. Dit model wordt gebruikt om het potentieel van muizen-MG te bestuderen om te converteren in retinale neuronen na suppletie of remming van microRNA’s (miRNA’s) via transfectie van kunstmatige miRNA’s of hun remmers. Het gebruik van MG-specifieke reportermuizen in combinatie met immunofluorescente etikettering en single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) bevestigde dat 80% -90% van de cellen in deze culturen MG zijn. Met behulp van dit model werd ontdekt dat miRNA’s MG kunnen herprogrammeren in retinale voorlopercellen (RPC’s), die vervolgens differentiëren in neuronaal-achtige cellen. De voordelen van deze techniek zijn dat miRNA-kandidaten kunnen worden getest op hun efficiëntie en uitkomst voordat ze in in vivo toepassingen worden gebruikt.

Introduction

De Müller glia (MG) zijn de overheersende glia in het neurale netvlies. Ze hebben vergelijkbare functies in vergelijking met andere glia in andere delen van het centrale zenuwstelsel, zoals het handhaven van de water- en ionhomeostase, het voeden van neuronen en het beschermen van het weefsel. MG hebben nog een fascinerend kenmerk: hoewel ze volwassen glia zijn, brengen ze nog steeds veel genen tot expressie die tot expressie komen in retinale voorlopercellen (RPC’s) tijdens de late ontwikkeling ^1,2. Deze gelijkenis wordt verondersteld de reden te zijn voor de natuurlijk voorkomende op MG gebaseerde neuronale regeneratie in het netvlies van vissen na retinale schade ^3,4. Tijdens dit proces komt MG opnieuw in de celcyclus en de-differentieert in RPC’s die vervolgens differentiëren in alle zes soorten retinale neuronen. Hoewel dit fenomeen van nature voorkomt bij vissen, zet mg van zoogdieren niet om in neuronen ^5,6. Ze kunnen echter worden geherprogrammeerd. Van een verscheidenheid aan factoren is aangetoond dat ze MG herprogrammeren in RPC’s / neuronen; een van deze factoren is de basis helix-loop-helix (bHLH) transcriptiefactor achaete-scute homoloog 1 (Ascl1) die betrokken is bij visregeneratie ^7,8. Bij muizen komt Ascl1 alleen tot expressie in RPC’s tijdens retinogenese, maar is afwezig in volwassen MG- of retinale neuronen⁹.

Het direct in vivo herprogrammeren van cellen is niet alleen methodologisch uitdagend, maar vereist ook goedkeuring van een instellingscommissie voor dierverzorging en -gebruik. Om goedkeuring te krijgen, zijn voorlopige gegevens nodig over de gebruikte of gewijzigde factor(en), concentraties, off-target effecten, onderliggende mechanismen, toxiciteit en efficiëntie. Celkweeksystemen maken het mogelijk om deze criteria te testen voordat ze in in vivo modellen worden gebruikt. Bovendien, aangezien MG slechts ongeveer 5% van de gehele retinale celpopulatie¹⁰ omvat, maken MG-culturen de studie van hun functie¹¹ en hun gedrag mogelijk, inclusief migratie^12,13, proliferatie¹⁴, stressreactie op letsel / schade^15,16, hun interactie met andere celtypen zoals microglia¹⁷ of retinale ganglioncellen (RGC’s)¹⁸, of hun neurogene potentieel 19,20,21. Veel onderzoekers gebruiken onsterfelijke cellijnen voor hun studies, omdat ze een onbeperkt proliferatief potentieel hebben en gemakkelijk kunnen worden onderhouden en getransfecteerd. Primaire cellen hebben echter de voorkeur voor biologisch relevante testen dan vereeuwigde cellen, omdat ze echte celkenmerken hebben (gen- en eiwitexpressie) en, nog belangrijker, ze vertegenwoordigen een bepaald stadium in ontwikkeling en hebben daarom een “leeftijd”. De leeftijd van een dier (en bijgevolg van de cellen verkregen van een dier) is een bijzonder cruciale factor bij cellulaire herprogrammering, omdat de plasticiteit van cellen afneemt met het gevorderde stadium van ontwikkeling²².

Dit protocol beschrijft in detail hoe primaire MG met miRNA’s kan worden geherprogrammeerd als een huidige in vitro methode voor het bestuderen van regeneratie. Dit MG primaire kweekmodel werd in 2012 opgericht om celproliferatiekenmerken van MG te evalueren bij P53 knock-out muizen (trp53-/- muizen)²³. Er werd aangetoond dat gekweekte MG hun gliale kenmerken behouden (d.w.z. expressie van S100β-, Pax6- en Sox2-eiwitten geëvalueerd via immunofluorescente etikettering), en dat ze lijken op in vivo MG (microarray van FACS-gezuiverde MG)²³. Kort daarna werden gliale mRNA en eiwitexpressie gevalideerd en bevestigd in een andere benadering met behulp van virale vectoren²⁰. Een paar jaar later werd bevestigd dat de overgrote meerderheid van de cellen in deze culturen MG zijn met behulp van de MG-specifieke Rlbp1^CreERT: tdTomato^{STOPfl / fl} reporter mouse²⁴. Bovendien toonde kwantificering van de set miRNA’s in zowel FACS-gezuiverde MG als gekweekte primaire MG aan dat de niveaus van MG miRNA’s (mGLiomiRs) niet veel variëren in gekweekte MG tijdens de groeifase. Langgerekte kweekperioden veroorzaken echter veranderingen in miRNA-niveaus en bijgevolg in mRNA-niveaus en eiwitexpressie, aangezien miRNA’s translationele regulatoren zijn²⁵.

In 2013 werd dit MG-cultuurmodel gebruikt om een verscheidenheid aan transcriptiefactoren te testen met betrekking tot hun vermogen om MG te herprogrammeren in retinale neuronen²⁰. Ascl1 bleek een zeer robuuste en betrouwbare herprogrammeringsfactor te zijn. Overexpressie van Ascl1 via virale vectoren veroorzaakte morfologische veranderingen, expressie van neuronale markers en de verwerving van neuronale elektrofysiologische eigenschappen. Wat nog belangrijker is, de inzichten en resultaten verkregen uit deze eerste in vitro experimenten werden met succes overgebracht naar in vivo toepassingen^{22,26 wat} aantoont dat primaire MG-culturen een solide en betrouwbaar hulpmiddel vormen voor initiële factorscreenings en evaluatie van gliale kenmerken voorafgaand aan in vivo implementatie.

Een paar jaar geleden werd aangetoond dat het met de hersenen verrijkte miRNA miR-124, dat ook sterk tot expressie komt in retinale neuronen, Ascl1-expressie kan induceren in gekweekte MG²¹. Ascl1-expressie in levende cellen werd gevisualiseerd via een Ascl1 reportermuis (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl). Een reportermuis is een genetisch gemanipuleerde muis waarvan een reporter-gen in zijn DNA is ingebracht. Dit reporter-gen codeert voor een reporter-eiwit, dat in deze studie tdTomato is, een rood fluorescerend eiwit. Dit reporter-eiwit rapporteert de expressie van een gen van belang, in dit geval Ascl1. Met andere woorden, cellen die Ascl1 tot expressie brengen, worden rood. Aangezien Ascl1 alleen tot expressie komt in RPC’s⁹, maakt deze Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl muis het mogelijk om mg-conversie te volgen in Ascl1-expresserende RPC’s, wat betekent dat converterende cellen rode fluorescerende tdTomato-reportereiwitten tot expressie zullen brengen. Dit is onomkeerbare etikettering omdat het DNA van deze cellen is veranderd. Bijgevolg zal elke daaropvolgende neuronale differentiatie worden gevisualiseerd omdat het tdTomato-label in differentiërende cellen blijft. Als Ascl1-expressie mg-afgeleide RPC’s (met tdTomato-label) differentiëren in neuronen, zullen deze neuronen nog steeds hun rode label hebben. Deze muis maakt daarom niet alleen de etikettering van MG-afgeleide RPC’s mogelijk voor live-cell imaging, maar maakt ook fate mapping en lineage tracing van deze MG-afgeleide (rode) RPC’s mogelijk. Meer recent werd de set miRNA’s in RPC’s geïdentificeerd en werden MG-culturen van Ascl1^CreERT: tdTomato^{STOPfl / fl} RPC-reporter-muizen gebruikt om het effect van deze miRNA’s op herprogrammeringscapaciteit en efficiëntie te screenen en te testen²⁷. Eén kandidaat, de RPC-miRNA miR-25, bleek in staat om gekweekte MG te herprogrammeren in Ascl1-expressie (Ascl1-Tomato+) cellen. Deze geherprogrammeerde cellen nemen in de loop van de tijd neuronale kenmerken aan, waaronder neuronale morfologie (kleine somata en korte of lange fijne processen), expressie van neuronale transcripten gemeten via scRNA-Seq, evenals expressie van neuronale eiwitten gevalideerd via immunofluorescente etikettering²⁷.

Hier beschrijft het protocol hoe MG te kweken en te transfecteren van P12-muizen aangepast van het vorige werk 21,24,27. Gekozen voor dit protocol is het eerder genoemde miRNA miR-25, een miRNA dat sterk tot expressie komt in RPC’s, met lage expressieniveaus in MG of retinale neuronen. Om miR-25 te overexpressie te geven, worden murine miR-25-mimiek, d.w.z. kunstmatige miRNA-moleculen gebruikt. Als controle worden mimics van een miRNA van Caenorhabditis elegans gekozen, die geen functie hebben in zoogdiercellen. Visualisatie van de omzetting van MG in RPC’s werd bereikt via de RPC reporter muis (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl), een muis met gemengde achtergrond (C57BL/6, S129 en ICR stammen). Deze kweek kan echter worden uitgevoerd met alle muizenstammen, inclusief wildtype stammen. In de afgelopen jaren is het oorspronkelijke protocol aangepast om de duur van de groeifase en de algehele kweekperiode te verminderen en een robuustere gliacelstatus te garanderen en de mate van cellulaire degeneratie, die optreedt in langdurige kweekperioden, te minimaliseren. Het reguliere transfectietijdvenster werd ook verlengd van 3 uur naar 2 dagen. Zoals eerder vermeld, hoewel het huidige protocol MG-culturen beschrijft als een hulpmiddel voor regeneratiestudies, is de methode niet alleen nuttig voor het testen van herprogrammeringsfactoren, maar kan deze ook worden aangepast voor andere toepassingen, waaronder studies over MG-migratie of proliferatief gedrag, letsel / celschade gerelateerde paradigma’s en / of de identificatie van onderliggende mechanismen en paden.

Protocol

Procedures met betrekking tot dierlijke proefpersonen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan het SUNY College of Optometry. OPMERKING: Dit kweekprotocol bestaat uit drie fasen: groei, transfectie en conversiefase. Een samenvatting van het algemene protocol met de tijdlijn wordt gegeven in figuur 1. 1. Bereiding van media en alle benodigde reagentia OPME…

Representative Results

Dit protocol beschrijft hoe MG uit de retinas van P12-muizen kan groeien en hoe deze cellen met miR-25 kunnen worden geherprogrammeerd tot retinale neuronen met behulp van de Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reportermuis. Deze methode werd gebruikt in eerder werk dat in detail andere geschikte miRNA’s (mimics of remmers, als enkele moleculen of in combinatie) rapporteerde om MG te herprogrammeren in RPC die vervolgens neuronale celkenmerken aannemen27. Deze metho…

Discussion

Dit protocol beschrijft hoe MG kan worden gekweekt uit gedissocieerde netvliezen van muizen voor herprogrammeringsstudies met behulp van miRNA’s. Zoals aangetoond en bevestigd in een verscheidenheid aan eerdere studies, is de overgrote meerderheid (80% -90%) van de cellen in deze culturen MG 20,23,24. Deze methode is een zeer robuuste en betrouwbare techniek en de resultaten kunnen gemakkelijk worden gereproduceerd als het proto…

Materials

Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J	Jax laboratories	#012882	Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	Jax laboratories	#007914	Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer	Sigma-Aldrich	H7904-5MG	reconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution	VWR	100504-782	2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-546-152	dilution 1:500
Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	705-606-147	dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems	Fisher Scientific	AF1979	dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M9942-200UL	dilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody	Antibodies-Online	ABIN334653	dilution 1:500
Ascorbic Acid	STEMCELL Technologies	72132	reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 Supplement	Fisher Scientific	17-504-044	frozen aliquots
Brain Phys Neuronal Medium	STEMCELL Technologies	05790	used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit	Fisher Scientific	C10340	reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMP	STEMCELL Technologies	73886	reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	MT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35010CV	frozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement	Fisher Scientific	51-985-034	store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Fisher Scientific	12-605-028	used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSS	Fisher Scientific	14-025-134	store at 4 °C
Laminin mouse protein, natural	Fisher Scientific	23-017-015	frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.164323 1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
L-Glutamine	Fisher Scientific	25-030-081	frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control	Horizon	CN-001000-01-50	reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic	Horizon	C-310564-05-0050	reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 Supplement	Fisher Scientific	17-502-048	frozen aliquots
Neurobasal Medium	Fisher Scientific	21-103-049	used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical	LK003153	reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific	15-140-122	frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P4538-50MG	reconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF Protein	R&D Systems	248-BDB-050/CF	reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF Protein	Fisher Scientific	2028EG200	reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF Protein	Fisher Scientific	512GF010	reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	712-296-150	dilution 1:1,000
Slide Mounting Medium	Fisher Scientific	OB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)	Fisher Scientific	L3000015	store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)	Eppendorf	2231300008
Disposable Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12	Fisher Scientific	08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24	Fisher Scientific	08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets	Fisher Scientific	13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets	Fisher Scientific	13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets	Fisher Scientific	13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam Gloves	Fisher Scientific	19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness)	Fisher Scientific	22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm	Fisher Scientific	09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinet	Thermo Scientific	1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810	Keyence	9011800000
Binocular Zoom Stereo Microscope	Vision Scientific	VS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)	VWR	25384-088
Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium	Fine Science Tools	11252-40
Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox	Fine Science Tools	11255-20
Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium	Fine Science Tools	11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 R	Eppendorf	2231000508
Fine Scissors-sharp	Fine Science Tools	14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cm	World Precision Instruments	14124
Metal bead bath	Lab Armor	74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm	VWR	82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)	Living Systems Instrumentation	DD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5	World Precision Instruments	501979
Water Jacketed CO2 Incubator	VWR	10810-744