Colture cellulari primarie per studiare il potenziale di rigenerazione di Murine Müller Glia dopo il trattamento con microRNA
Summary
Le colture primarie di glia di Müller ottenute da retine di topo rappresentano uno strumento molto robusto e affidabile per studiare la conversione gliale in cellule progenitrici retiniche dopo il trattamento con microRNA. Singole molecole o combinazioni possono essere testate prima della loro successiva applicazione di approcci in vivo .
Abstract
La glia di Müller (MG) è la glia predominante nella retina neurale e può funzionare come fonte rigenerativa per i neuroni retinici. Nei vertebrati inferiori come i pesci, la rigenerazione guidata da MG avviene naturalmente; nei mammiferi, tuttavia, è necessaria la stimolazione con determinati fattori o la manipolazione genetica/ epigenetica. Poiché le MG comprendono solo il 5% della popolazione di cellule retiniche, vi è la necessità di sistemi modello che consentano esclusivamente lo studio di questa popolazione cellulare. Uno di questi sistemi modello sono colture PRIMARIE DI MG riproducibili e possono essere utilizzate per una varietà di applicazioni, tra cui lo screening e l’identificazione di molecole / fattori, test di composti o fattori, monitoraggio cellulare e / o test funzionali. Questo modello viene utilizzato per studiare il potenziale della MG murina di convertirsi in neuroni retinici dopo l’integrazione o l’inibizione di microRNA (miRNA) tramite trasfezione di miRNA artificiali o dei loro inibitori. L’uso di topi reporter mg-specifici in combinazione con l’etichettatura immunofluorescente e il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha confermato che l’80%-90% delle cellule trovate in queste colture sono MG. Utilizzando questo modello, è stato scoperto che i miRNA possono riprogrammare MG in cellule progenitrici retiniche (RPC), che successivamente si differenziano in cellule neuronali. I vantaggi di questa tecnica sono che i candidati miRNA possono essere testati per la loro efficienza e il loro risultato prima del loro utilizzo in applicazioni in vivo .
Introduction
La glia di Müller (MG) è la glia predominante nella retina neurale. Hanno funzioni simili rispetto ad altre glia in altre parti del sistema nervoso centrale come il mantenimento dell’omeostasi dell’acqua e degli ioni, il nutrimento dei neuroni e la protezione del tessuto. Le MG hanno un’altra caratteristica affascinante: sebbene siano glia mature, esprimono ancora molti geni espressi nelle cellule progenitrici retiniche (RPC) durante lo sviluppo tardivo 1,2. Si presume che questa somiglianza sia la ragione della rigenerazione neuronale naturale basata su MG nella retina del pesce dopo il danno retinico 3,4. Durante questo processo, mg rientra nel ciclo cellulare e si de-differenzia in RPC che poi si differenziano in tutti e sei i tipi di neuroni retinici. Sebbene questo fenomeno si verifichi naturalmente nei pesci, i mammiferi MG non si convertono in neuroni 5,6. Possono, tuttavia, essere riprogrammati. Una varietà di fattori hanno dimostrato di riprogrammare MG in RPC / neuroni; tra questi fattori c’è il fattore di trascrizione di base helix-loop-helix (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1) che è coinvolto nella rigenerazione dei pesci 7,8. Nei topi, Ascl1 è espresso solo in RPC durante la retinogenesi, ma è assente nei neuroni MG maturi o retinici9.
La riprogrammazione delle cellule direttamente in vivo non è solo metodologicamente impegnativa, ma richiede anche l’approvazione di un comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali. Per ricevere l’approvazione, sono necessari dati preliminari sui fattori utilizzati o alterati, sulle concentrazioni, sugli effetti fuori bersaglio, sui meccanismi sottostanti, sulla tossicità e sull’efficienza. I sistemi di coltura cellulare consentono di testare questi criteri prima dell’uso in modelli in vivo. Inoltre, poiché le MG comprendono solo circa il 5% dell’intera popolazione di cellule retiniche10, le colture di MG consentono lo studio della loro funzione11 e del loro comportamento, compresa la migrazione12,13, la proliferazione14, la reazione allo stress a lesioni/danni 15,16, la loro interazione con altri tipi di cellule come la microglia17 o le cellule gangliari retiniche (RGC)18, o il loro potenziale neurogeno 19,20,21. Molti ricercatori utilizzano linee cellulari immortalizzate per i loro studi poiché hanno un potenziale proliferativo illimitato e possono essere facilmente mantenute e trasfettate. Le cellule primarie, tuttavia, sono preferibili per saggi biologicamente rilevanti rispetto alle cellule immortalizzate poiché hanno caratteristiche cellulari reali (espressione genica e proteica) e, cosa più importante, rappresentano un certo stadio di sviluppo e quindi hanno una “età”. L’età di un animale (e di conseguenza delle cellule ottenute da un animale) è un fattore particolarmente cruciale nella riprogrammazione cellulare poiché la plasticità cellulare si riduce con lo stadio di sviluppo progredito22.
Questo protocollo descrive in dettaglio come riprogrammare MG primario con miRNA come metodo attuale in vitro per lo studio della rigenerazione. Questo modello di coltura primaria mg è stato stabilito nel 2012 per valutare le caratteristiche di proliferazione cellulare di MG in topi knock-out P53 (topi trp53-/-)23. È stato dimostrato che le MG coltivate mantengono le loro caratteristiche gliali (cioè l’espressione delle proteine S100β, Pax6 e Sox2 valutate tramite etichettatura immunofluorescente) e che assomigliano a MG in vivo (microarray di MG purificato con FACS)23. Poco dopo, l’mRNA gliale e l’espressione proteica sono stati convalidati e confermati in un approccio diverso utilizzando vettori virali20. Alcuni anni dopo, è stato confermato che la stragrande maggioranza delle cellule trovate in queste colture sono MG utilizzando il topo reporter Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 24 specifico per MG. Inoltre, la quantificazione dell’insieme dei miRNA sia nella MG purificata dalla FACS che nella MG primaria in coltura ha mostrato che i livelli di MG miRNA (mGLiomiRs) non variano molto nella MG coltivata durante la fase di crescita. I periodi di coltura allungati, tuttavia, causano cambiamenti nei livelli di miRNA e di conseguenza nei livelli di mRNA e nell’espressione proteica poiché i miRNA sono regolatori traslazionali25.
Nel 2013, questo modello di coltura MG è stato utilizzato per testare una varietà di fattori di trascrizione rispetto alla loro capacità di riprogrammare MG in neuroni retinici20. Ascl1 è risultato essere un fattore di riprogrammazione molto robusto e affidabile. La sovraespressione di Ascl1 tramite vettori virali ha indotto cambiamenti morfologici, espressione di marcatori neuronali e acquisizione di proprietà elettrofisiologiche neuronali. Ancora più importante, le intuizioni e i risultati ottenuti da questi primi esperimenti in vitro sono stati trasferiti con successo alle applicazioni in vivo 22,26 dimostrando che le colture primarie di MG rappresentano uno strumento solido e affidabile per gli screening fattoriali iniziali e la valutazione delle caratteristiche gliali prima dell’implementazione in vivo.
Alcuni anni fa, è stato dimostrato che il miRNA miR-124 arricchito dal cervello, che è anche altamente espresso nei neuroni della retina, può indurre l’espressione di Ascl1 deMG 21 coltivato. L’espressione di Ascl1 nelle cellule viventi è stata visualizzata tramite un topo reporter Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Un topo reporter è un topo geneticamente modificato che ha un gene reporter inserito nel suo DNA. Questo gene reporter codifica per una proteina reporter, che è in questo studio tdTomato, una proteina fluorescente rossa. Questa proteina reporter riporta l’espressione di un gene di interesse, in questo caso, Ascl1. In altre parole, le celle che esprimono Ascl1 diventeranno rosse. Poiché Ascl1 è espresso solo in RPC9, questo mouse Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl consente il monitoraggio della conversione MG in RPC che esprimono Ascl1 , il che significa che le cellule in conversione esprimeranno la proteina reporter tdTomato fluorescente rossa. Questa è un’etichettatura irreversibile poiché il DNA di queste cellule è alterato. Di conseguenza, qualsiasi successiva differenziazione neuronale verrà visualizzata perché l’etichetta tdTomato rimane nelle cellule differenzianti. Se Ascl1 che esprime RPC derivate da MG (con etichetta tdTomato) si differenzia in neuroni, questi neuroni avranno ancora la loro etichetta rossa. Questo topo, quindi, consente non solo l’etichettatura di RPC derivati da MG per l’imaging di cellule vive, ma consente anche la mappatura del destino e il tracciamento del lignaggio di questi RPC (rossi) derivati da MG. Più recentemente, è stato identificato il set di miRNA nelle RPC e sono state utilizzate colture MG di topi ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter per lo screening e il test dell’effetto di questi miRNA sulla capacità di riprogrammazione e sull’efficienza27. Un candidato, l’RPC-miRNA miR-25, è stato trovato in grado di riprogrammare MG coltivato in cellule che esprimono Ascl1 (Ascl1-Tomato +). Queste cellule riprogrammate adottano caratteristiche neuronali nel tempo, tra cui la morfologia neuronale (piccoli somata e processi fini brevi o lunghi), l’espressione di trascritti neuronali misurati tramite scRNA-Seq, nonché l’espressione di proteine neuronali convalidate tramite l’etichettatura immunofluorescente27.
Qui, il protocollo descrive in dettaglio come coltivare e trasfettare MG da topi P12 adattati dal lavoro precedente 21,24,27. Scelto per questo protocollo è il già citato miRNA miR-25, un miRNA altamente espresso in RPC, con bassi livelli di espressione in MG o neuroni retinici. Per sovraesprimere miR-25, mi mimica miR-25 murina, cioè vengono utilizzate molecole di miRNA artificiali. Come controllo, vengono scelte imitazioni di un miRNA da Caenorhabditis elegans, che non hanno alcuna funzione nelle cellule di mammifero. La visualizzazione della conversione di MG in RPC è stata effettuata tramite il mouse reporter RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), un mouse con sfondo misto (ceppi C57BL/6, S129 e ICR). Questa coltura può, tuttavia, essere eseguita con tutti i ceppi di topo, compresi i ceppi wild-type. Negli ultimi anni, il protocollo originale è stato modificato per ridurre la durata della fase di crescita e il periodo di coltura complessivo e garantire uno stato delle cellule glialiche più robusto e ridurre al minimo il grado di degenerazione cellulare, che si verifica in periodi di coltura prolungati. Anche la finestra temporale di trasfezione regolare è stata estesa da 3 ore a 2 giorni. Come accennato in precedenza, sebbene l’attuale protocollo descriva le colture MG come strumento per gli studi di rigenerazione, il metodo non è solo utile per testare i fattori di riprogrammazione, ma può anche essere adattato per altre applicazioni, inclusi studi sul comportamento migratorio o proliferativo della MG, paradigmi correlati a lesioni / danni cellulari e / o l’identificazione di meccanismi e percorsi sottostanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive come far crescere MG da retine di topo dissociate per riprogrammare studi che utilizzano miRNA. Come mostrato e confermato in una varietà di studi precedenti, la stragrande maggioranza (80%-90%) delle cellule trovate in queste colture sono MG 20,23,24. Questo metodo è una tecnica molto robusta e affidabile e i risultati possono essere facilmente riprodotti se il protocollo viene seguito correttamente…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano la dottoressa Ann Beaton e tutti i membri del laboratorio per il loro contributo al manoscritto. Un ringraziamento speciale va ai dottori Tom Reh, Julia Pollak e Russ Taylor per aver introdotto le culture primarie MG come strumento di screening per S.G.W. durante la formazione post-dottorato presso l’Università di Washington a Seattle. Lo studio è stato finanziato dall’Empire Innovation Program (EIP) Grant a S.G.W. e fondi di start-up da SUNY Optometry a S.G.W., nonché dal premio R01EY032532 dal National Eye Institute (NEI) a S.G.W.
Materials
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 |
frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
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