Method Article

Cultures cellulaires primaires pour étudier le potentiel de régénération de murin Müller Glia après un traitement par microARN

DOI:

10.3791/63651

⸱

March 28th, 2022

 , 
1Department of Biological and Vision Sciences, College of Optometry, The State University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cultures primaires de glie de Müller obtenues à partir de rétines de souris représentent un outil très robuste et fiable pour étudier la conversion gliale en cellules progénitrices rétiniennes après un traitement par microARN. Des molécules uniques ou des combinaisons peuvent être testées avant leur application ultérieure d’approches in vivo .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La glie de Müller (MG) est la glie prédominante dans la rétine neurale et peut fonctionner comme une source régénératrice pour les neurones rétiniens. Chez les vertébrés inférieurs tels que les poissons, la régénération entraînée par MG se produit naturellement; chez les mammifères, cependant, une stimulation avec certains facteurs ou une manipulation génétique / épigénétique est nécessaire. Étant donné que les MG ne représentent que 5% de la population cellulaire rétinienne, il existe un besoin de systèmes modèles permettant l’étude exclusive de cette population cellulaire. L’un de ces systèmes modèles est constitué de cultures MG primaires qui sont reproductibles et peuvent être utilisées pour une variété d’applications, y compris le criblage et l’identification de molécules / facteurs, le test de composés ou de facteurs, la surveillance cellulaire et / ou des tests fonctionnels. Ce modèle est utilisé pour étudier le potentiel de la MG murine à se convertir en neurones rétiniens après supplémentation ou inhibition des microARN (miARN) par transfection de miARN artificiels ou de leurs inhibiteurs. L’utilisation de souris rapporteures spécifiques à MG en combinaison avec le marquage immunofluorescent et le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) a confirmé que 80% à 90% des cellules trouvées dans ces cultures sont MG. En utilisant ce modèle, il a été découvert que les miARN peuvent reprogrammer MG en cellules progénitrices rétiniennes (RPC), qui se différencient ensuite en cellules neuronales. Les avantages de cette technique sont que les candidats miARN peuvent être testés pour leur efficacité et leurs résultats avant leur utilisation dans des applications in vivo .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La glie de Müller (MG) est la glie prédominante dans la rétine neurale. Ils ont des fonctions similaires à celles d’autres glies dans d’autres parties du système nerveux central, telles que le maintien de l’homéostasie de l’eau et des ions, la nutrition des neurones et la protection des tissus. Les MG ont une autre caractéristique fascinante : bien qu’ils soient des glie matures, ils expriment encore de nombreux gènes exprimés dans les cellules progénitrices rétiniennes (RPC) à la fin du développement 1,2. Cette ressemblance est supposée être la raison de la régénération neuronale naturelle à base de MG dans l....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du SUNY College of Optometry.

REMARQUE: Ce protocole de culture se compose de trois phases: la croissance, la transfection et la phase de conversion. Un résumé du protocole global avec la chronologie est donné à la figure 1.

1. Préparation des milieux et de tous les réactifs requis

REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité (BSC) A2 ou B2. Pendant la phase de crois....

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Results

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Ce protocole décrit comment cultiver mg à partir de rétines de souris P12 et comment reprogrammer ces cellules avec miR-25 en neurones rétiniens à l’aide de la souris rapporteur Ascl1 CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Cette méthode a été utilisée dans des travaux antérieurs rapportant en détail d’autres miARN appropriés (mimiques ou inhibiteurs, en tant que molécules uniques ou en combinaison) pour reprogrammer MG en RPC qui adoptent ensuite les caractéristiques des cellules neuronales

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Discussion

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Ce protocole décrit comment cultiver la MG à partir de rétines de souris dissociées pour des études de reprogrammation à l’aide de miARN. Comme l’ont montré et confirmé diverses études antérieures, la grande majorité (80% à 90%) des cellules trouvées dans ces cultures sont MG 20,23,24. Cette méthode est une technique très robuste et fiable et les résultats peuvent être facilement reproduits si le protocole est suivi correctement.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un brevet incluant certaines des conclusions de ce rapport a été déposé par l’Université de Washington auprès des inventeurs Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl et Thomas A. Reh. Le brevet s’intitule « Méthodes et compositions pour stimuler la régénération rétinienne.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient la Dre Ann Beaton et tous les membres du laboratoire pour leur contribution au manuscrit. Nous remercions tout particulièrement les Drs Tom Reh, Julia Pollak et Russ Taylor d’avoir présenté les cultures primaires MG comme outil de dépistage à S.G.W. lors d’une formation postdoctorale à l’Université de Washington à Seattle. L’étude a été financée par la subvention empire innovation program (EIP) à S.G.W. et des fonds de démarrage de SUNY Optometry à S.G.W., ainsi que par le prix R01EY032532 du National Eye Institute (NEI) à S.G.W.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Ascl1-CreERT souris Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JJax laboratories#012882Ascl1-CreERT ont été croisées avec des souris tdTomato
tdTomato-STOPfl/fl souris  ; N° B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JJax laboratories#007914Le génotypage est nécessaire pour identifier les souris Ascl1CreER positives
réactifs
(Z)-4-Hydroxytamoxifène, &ge ; Isomère Z à 98 %Sigma-AldrichH7904-5MGreconstitué dans de l’éthanol, aliquotes congelées
16 % Paraformaldéhyde (PFA) Solution aqueuseVWR100504-7822 % PFA à base de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), aliquotes congelées
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152dilution 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment d’âne Anti-chèvre IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories705-606-147dilution 1:500
Anticorps anti-Otx2 humain, R& D SystemsFisher ScientificAF1979dilution 1:500
Anticorps anti-lapin MAP2Sigma-AldrichM9942-200ULdilution 1:250
Anticorps anti-protéine fluorescente rouge (RFP)Anticorps en ligneABIN334653dilution 1:500
Acide ascorbiqueSTEMCELL Technologies72132reconstitué dans PBS, aliquotes congelées
B-27 SupplémentFisher Scientific17-504-044aliquotes congelées
Brain Phys NeuronalMedium STEMCELL Technologies05790utilisé comme milieu neuronal dans la section 1.2, stocker à 4 ° ; C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitFisher ScientificC10340reconstituer suivant le manuel, 4° ; C
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73886reconstitué dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO), aliquotes congelées
sulfoxyde de diméthyle (DMSO)Fisher ScientificMT-25950CQC
Sérum de veau fœtal (FBS)Fisher ScientificMT35010CValiquotes congelées
Gibco  ; Opti-MEM Sérum Réduit Medium, Supplément GlutaMAXFisher Scientific51-985-034stocker à 4 ° ; C
Gibco  ; TrypLE Express Enzyme (1X), rouge de phénolFisher Scientific12-605-028utilisé comme solution contenant de la trypsine, conserver à 4 ° ; C
HBSSFisher Scientific14-025-134magasin au 4 ° ; C
Protéine de souris laminine, naturelleFisher Scientific23-017-015

aliquotes congelées, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-GlutamineFisher Scientific25-030-081aliquotes congelées
miRIDIAN microRNA Mimic Negative ControlHorizonCN-001000-01-50reconstituées dans de l’eau libre de RNase (200 µ ; M), aliquotes
congelées miRIDIAN microARN Souris mmu-miR-25-3p mimiqueHorizonC-310564-05-0050reconstitué dans de l’eau libre de RNase (200 µ ; M), aliquotes congelées
N-2 SupplémentFisher Scientific17-502-048aliquotes congelées
Milieu neurobasalFisher Scientific21-103-049utilisées pour le milieu de croissance à la section 1.1, conserver à 4 ° ; C
Système de dissociation de la papaïneWorthington LK003153 biochimiquereconstitué dans une solution saline équilibrée d’Earle, aliquotes congelées
Pénicilline StreptomycineFisher Scientific15-140-122Aliquotes congelées
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Fisher Scientific20-012-043
Bromhydrate de poly-L-ornithineSigma-AldrichP4538-50MGreconstitué dans de l’eau stérilisée, aliquotes congelées Recombinant
Human BDNF ProteinR& D Systems248-BDB-050/CFreconstitué dans du PBS et du FBS stérilisés, aliquotes congelées
Souris recombinante Protéine EGFFisher Scientific2028EG200reconstituée dans du PBS stérilisé, aliquotes congelées
Rat recombinant Protéine GDNF FisherScientific512GF010reconstituée dans du PBS stérilisé, aliquotes congelées
Rhodamine Rouge 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment d’âne anti-rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories712-296-150Dilution 1:1,000
Medium de montage de lamesFisher ScientificOB100-01
Réactif de transfection (Lipofectamine 3000)Fisher ScientificL3000015magasin à 4 ° ; C
plasticware/supplies
Tube à microcentrifuger de 0,6 mLFisher Scientific50-408-120
Tube de microcentrifugation de 1,5 mLFisher Scientific50-408-129
10 µ ; L POURBOIRE  ; filtre stérile Pointes de pipetteFisher Scientific02-707-439
100 & micro ; L POURBOIRE  ; filtre stérile Pointes de pipetteFisher Scientific02-707-431
1000 µ ; L TIP filtre stérile Pointes de pipetteFisher Scientific02-707-404
2,0 mL Tube à centrifugerFisher Scientific50-408-138
20 & micro ; L POURBOIRE  ; filtre stérile Pointes de pipetteFisher Scientific02-707-432
Pipettes à volume réglable (2,5, 10, 20, 100, 200, & 1000 & micro ; L)Eppendorf2231300008
Pipettes de transfert jetablesFisher Scientific13-669-12
Plaques à fond plat multipuits avec couvercles, nombre de puits = 12Fisher Scientific08-772-29
Plaques à fond plat multipuits avec couvercles, nombre de puits = 24Fisher Scientific08-772-1
Filtre stérile PIPET 10ML Sérologique jetable PipettesFisher Scientific13-676-10J
Filtre stérile PIPETER 50ML Pipettes sérologiques jetablesFisher Scientific13-676-10Q
Filtre stérile PIPETER 5ML Pipettes sérologiques jetablesFisher Scientific13-676-10H
Gants d’examen en nitrile non poudrésFisher Scientific19-130-1597B
Lamelles rondes (12 mm de diamètre, 0,17 - 0,25 mm d’épaisseur)Fisher Scientific22293232 Filtre à
vide, taille des pores = 0,22 & micro ; mFisher Scientific09-761-106
equipment
1300 B2 Armoire de biosécuritéThermo Scientific1310
Microscope à fluorescence tout-en-un Keyence BZ-X 810Keyence9011800000
Zoom binoculaire StéréomicroscopeVision ScientificVS-1EZ-IFR07
Boîtes de Pétri jetables (100 mm de diamètre)VWR25384-088
Pince Dumont #5 - Biologie/TitaniumFine Science Tools11252-40
Dumont #55 Forceps - Biologie/InoxFine ScienceTools 11255-20
Dumont #7 Pince incurvée - Biologie/TitaniumFine Science Tools11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 REppendorf
Ciseaux fins-SharpFine Science Tools14058-11
Ciseaux McPherson-Vannas, 8 cmWorld Precision Instruments14124
Bain de perles métalliquesLab Armor74309-714
Mélangeur à nutation, électrique=115V, 60Hz, Vitesse=24 tr/minVWR82007-202
Dissection recouverte de silicone Boîte de Pétri (90 mm diamètre)Living Systems InstrumentationDD-ECON-90-BLK-5PK
Pince à épiler, économie #5World Precision Instruments501979
Incubateur CO2 à chemise d’eauVWR10810-744
souris du2231000508

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
  2. Roesch, K., et al. The transcript....

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Muller GliaPrimary Cell CultureMicroRNA TreatmentRetinal Progenitor CellsRetinal RegenerationImmunofluorescent LabelingSingle Cell RNA SequencingNeuronal DifferentiationCell TransfectionRegenerative Medicine

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