Primære cellekulturer for å studere regenereringspotensialet til Murine Müller Glia etter microRNA-behandling

Summary

Müller glia primære kulturer hentet fra musehinnen representerer et meget robust og pålitelig verktøy for å studere glialkonvertering til retinale stamceller etter mikroRNA-behandling. Enkeltmolekyler eller kombinasjoner kan testes før deres påfølgende anvendelse av in vivo-tilnærminger .

Abstract

Müller glia (MG) er den dominerende glia i nevral retina og kan fungere som en regenerativ kilde for retinale nevroner. Hos lavere virveldyr som fisk forekommer MG-drevet regenerering naturlig; hos pattedyr er det imidlertid nødvendig med stimulering med visse faktorer eller genetisk/epigenetisk manipulasjon. Siden MG bare utgjør 5% av retinalcellepopulasjonen, er det behov for modellsystemer som utelukkende tillater studier av denne cellepopulasjonen. Et av disse modellsystemene er primære MG-kulturer som er reproduserbare og kan brukes til en rekke applikasjoner, inkludert screening og identifisering av molekyler / faktorer, testing av forbindelser eller faktorer, celleovervåking og / eller funksjonstester. Denne modellen brukes til å studere potensialet til murine MG for å konvertere til retinale nevroner etter tilskudd eller inhibering av mikroRNA (miRNA) via transfeksjon av kunstige miRNA eller deres hemmere. Bruken av MG-spesifikke reportermus i kombinasjon med immunfluorescerende merking og enkeltcellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) bekreftet at 80% -90% av cellene som finnes i disse kulturene er MG. Ved hjelp av denne modellen ble det oppdaget at miRNA kan omprogrammere MG til retinale stamceller (RPC), som senere skiller seg ut i nevronlignende celler. Fordelene med denne teknikken er at miRNA-kandidater kan testes for effektivitet og utfall før de brukes i in vivo-applikasjoner .

Introduction

Müller glia (MG) er den dominerende glia i nevral retina. De har lignende funksjoner sammenlignet med andre glia i andre deler av sentralnervesystemet, for eksempel å opprettholde vann- og ionhomeostase, nærende nevroner og beskytte vevet. MG har en annen fascinerende funksjon: selv om de er modne glia, uttrykker de fortsatt mange gener uttrykt i retinale stamceller (RPC) under sen utvikling ^1,2. Denne likheten antas å være årsaken til den naturlig forekommende MG-baserte nevronregenereringen i fiskehinnen etter retinal skade ^3,4. I løpet av denne prosessen går MG inn i cellesyklusen og de-differensierer til RPC-er som deretter differensierer i alle seks typer retinale nevroner. Selv om dette fenomenet forekommer naturlig i fisk, konverterer ikke pattedyr MG til nevroner ^5,6. De kan imidlertid omprogrammeres. En rekke faktorer har vist seg å omprogrammere MG til RPC/nevroner; blant disse faktorene er den grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) transkripsjonsfaktoren achaete-scute homolog 1 (Ascl1) som er involvert i fiskregenerering ^7,8. Hos mus uttrykkes Ascl1 bare i RPC under retinogenese, men er fraværende i modne MG- eller retinale nevroner⁹.

Omprogrammering av celler direkte in vivo er ikke bare metodisk utfordrende, men krever også godkjenning fra en institusjonell dyrepleie- og brukskomité. For å motta godkjenning kreves foreløpige data om faktoren(e) som er brukt eller endret, konsentrasjoner, off-target effekter, underliggende mekanismer, toksisitet og effektivitet. Cellekultursystemer tillater testing for disse kriteriene før bruk i in vivo-modeller. Videre, siden MG bare utgjør omtrent 5% av hele retinalcellepopulasjonen¹⁰, tillater MG-kulturer studier av deres funksjon¹¹ også deres oppførsel, inkludert migrasjon^12,13, spredning¹⁴, stressreaksjon på skade / skade^15,16, deres interaksjon med andre celletyper som microglia¹⁷ eller retinale ganglionceller (RGCs)¹⁸, eller deres nevrogene potensial 19,20,21. Mange forskere bruker udødelige cellelinjer for sine studier siden de har et ubegrenset proliferativt potensial og lett kan vedlikeholdes og transfectederes. Primære celler er imidlertid å foretrekke for biologisk relevante analyser enn immortaliserte celler siden de har sanne celleegenskaper (gen- og proteinuttrykk), og enda viktigere, de representerer et bestemt utviklingsstadium og derfor har en “alder”. Alderen til et dyr (og følgelig av cellene hentet fra et dyr) er en spesielt avgjørende faktor i cellulær omprogrammering siden celleplastisiteten reduseres med utviklet utviklingsstadium²².

Denne protokollen beskriver i detalj hvordan man omprogrammerer primær MG med miRNA som en nåværende in vitro-metode for å studere regenerering. Denne MG primære kulturmodellen ble etablert i 2012 for å evaluere celleproliferasjonsegenskaper for MG i P53 knock-out mus (trp53-/- mus)²³. Det ble vist at kultivert MG opprettholder sine glialegenskaper (dvs. ekspresjon av S100β-, Pax6- og Sox2-proteiner evaluert via immunfluorescerende merking), og at de ligner in vivo MG (mikromatrise av FACS-renset MG)²³. Kort tid etter ble glial mRNA og proteinuttrykk validert og bekreftet i en annen tilnærming ved bruk av virale vektorer²⁰. Noen år senere ble det bekreftet at de aller fleste cellene som finnes i disse kulturene er MG ved hjelp av MG-spesifikke Rlbp1^CreERT: tdTomato^{STOPfl / fl} reporter mus²⁴. Videre viste kvantifisering av settet av miRNA i både FACS-renset MG og kultivert primær MG at nivåene av MG miRNA (mGLiomiRs) ikke varierer mye i kultivert MG i vekstfasen. Langstrakte kulturperioder forårsaker imidlertid endringer i miRNA-nivåer og følgelig i mRNA-nivåer og proteinuttrykk siden miRNA er translasjonsregulatorer²⁵.

I 2013 ble denne MG-kulturmodellen brukt til å teste en rekke transkripsjonsfaktorer med hensyn til deres evne til å omprogrammere MG til retinale nevroner²⁰. Ascl1 ble funnet å være en svært robust og pålitelig omprogrammeringsfaktor. Overekspresjon av Ascl1 via virale vektorer induserte morfologiske endringer, ekspresjon av nevronmarkører og oppkjøp av nevronale elektrofysiologiske egenskaper. Enda viktigere, innsikten og resultatene fra disse første in vitro-eksperimentene ble vellykket overført til in vivo-applikasjoner ^22,26 som viser at primære MG-kulturer representerer et solid og pålitelig verktøy for innledende faktorscreening og evaluering av glialfunksjoner før in vivo implementering.

For noen år siden ble det vist at hjerneberiket miRNA miR-124, som også er sterkt uttrykt i retinale nevroner, kan indusere Ascl1-uttrykk i dyrket MG²¹. Ascl1-uttrykk i levende celler ble visualisert via en Ascl1 reportermus (Ascl1^CreERT: tdTomato^{STOPfl / fl}). En reportermus er en genmodifisert mus som har et reportergen satt inn i sitt DNA. Dette reportergenet koder for et reporterprotein, som er i denne studien tdTomato, et rødt fluorescerende protein. Dette reporterproteinet rapporterer uttrykket av et gen av interesse, i dette tilfellet Ascl1. Med andre ord, celler som uttrykker Ascl1 vil bli røde. Siden Ascl1 bare uttrykkes i RPC⁹, tillater denne Ascl1^CreERT: tdTomato^{STOPfl / fl-musen} sporing av MG-konvertering til Ascl1-uttrykk for RPC-er, noe som betyr at konvertering av celler vil uttrykke rødt fluorescerende tdTomato reporterprotein. Dette er irreversibel merking siden DNA fra disse cellene er endret. Følgelig vil enhver etterfølgende nevrondifferensiering bli visualisert fordi tdTomato-etiketten forblir i differensierende celler. Hvis Ascl1 som uttrykker MG-avledede RPC-er (med tdTomato-etikett) skiller seg ut i nevroner, vil disse nevronene fortsatt ha sin røde etikett. Denne musen tillater derfor ikke bare merking av MG-avledede RPC-er for levende celleavbildning, men tillater også skjebnekartlegging og avstamningssporing av disse MG-avledede (røde) RPC-ene. Mer nylig ble settet med miRNA i RPC-er identifisert, og MG-kulturer av Ascl1^CreERT: tdTomato^{STOPfl / fl} RPC-reportermus ble brukt til å skjerme og teste effekten av disse miRNA-ene på omprogrammeringskapasitet og effektivitet²⁷. En kandidat, RPC-miRNA miR-25, ble funnet i stand til å omprogrammere kultivert MG til Ascl1-uttrykkende (Ascl1-Tomato +) celler. Disse omprogrammerte cellene adopterer nevronale egenskaper over tid, inkludert nevronmorfologi (liten somata og enten korte eller lange fine prosesser), uttrykk for nevronale transkripsjoner målt via scRNA-Seq, samt ekspresjon av nevronproteiner validert via immunfluorescerende merking²⁷.

Her beskriver protokollen hvordan man dyrker og transfekterer MG fra P12-mus tilpasset fra forrige arbeid 21,24,27. Valgt for denne protokollen er den nevnte miRNA miR-25, et miRNA sterkt uttrykt i RPC, med lave ekspresjonsnivåer i MG eller retinale nevroner. For å overuttrykke miR-25, brukes murine miR-25 etterligner, dvs. kunstige miRNA-molekyler. Som en kontroll velges etterligninger av et miRNA fra Caenorhabditis elegans, som ikke har noen funksjon i pattedyrceller. Visualisering av konverteringen av MG til RPC-er ble oppnådd via RPC-reportermusen (Ascl1^CreERT: tdTomato^{STOPfl / fl}), en mus med blandet bakgrunn (C57BL / 6, S129 og ICR-stammer). Denne kulturen kan imidlertid utføres med alle musestammer, inkludert villtypestammer. I løpet av de siste årene har den opprinnelige protokollen blitt modifisert for å redusere vekstfasevarigheten og den generelle kulturperioden og sikre en mer robust gliacellestatus og minimere graden av cellulær degenerasjon, som oppstår i lengre kulturperioder. Det vanlige transfeksjonstidsvinduet ble også utvidet fra 3 timer til 2 dager. Som nevnt tidligere, selv om den nåværende protokollen beskriver MG-kulturer som et verktøy for regenereringsstudier, er metoden ikke bare nyttig for å teste omprogrammeringsfaktorer, men kan også tilpasses for andre applikasjoner, inkludert studier om MG-migrerende eller proliferativ oppførsel, skade / celleskaderelaterte paradigmer og / eller identifisering av underliggende mekanismer og veier.

Protocol

Prosedyrer som involverer dyrefag er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved SUNY College of Optometry. MERK: Denne kulturprotokollen består av tre faser: vekst, transfeksjon og konverteringsfase. Et sammendrag av den samlede protokollen med tidslinjen er gitt i figur 1. 1. Fremstilling av media og alle nødvendige reagenser MERK: Alle trinn må utføres i et A2- el…

Representative Results

Denne protokollen beskriver hvordan du dyrker MG fra P12 musehinner og hvordan du omprogrammerer disse cellene med miR-25 til retinale nevroner ved hjelp av Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC reportermus. Denne metoden ble brukt i tidligere arbeidsrapportering i detalj andre egnede miRNA (etterligner eller hemmere, som enkeltmolekyler eller i kombinasjon) for å omprogrammere MG til RPC som deretter vedtar nevroncelleegenskaper27. Denne metoden har blitt modifisert…

Discussion

Denne protokollen beskriver hvordan man dyrker MG fra dissosierte musehinner for omprogrammering av studier ved bruk av miRNA. Som vist og bekreftet i en rekke tidligere studier, er det store flertallet (80% -90%) av cellene som finnes i disse kulturer MG 20,23,24. Denne metoden er en veldig robust og pålitelig teknikk, og resultatene kan enkelt reproduseres hvis protokollen følges riktig^{21,27</sup…}

Materials

Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J	Jax laboratories	#012882	Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	Jax laboratories	#007914	Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer	Sigma-Aldrich	H7904-5MG	reconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution	VWR	100504-782	2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-546-152	dilution 1:500
Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	705-606-147	dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems	Fisher Scientific	AF1979	dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M9942-200UL	dilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody	Antibodies-Online	ABIN334653	dilution 1:500
Ascorbic Acid	STEMCELL Technologies	72132	reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 Supplement	Fisher Scientific	17-504-044	frozen aliquots
Brain Phys Neuronal Medium	STEMCELL Technologies	05790	used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit	Fisher Scientific	C10340	reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMP	STEMCELL Technologies	73886	reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	MT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35010CV	frozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement	Fisher Scientific	51-985-034	store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Fisher Scientific	12-605-028	used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSS	Fisher Scientific	14-025-134	store at 4 °C
Laminin mouse protein, natural	Fisher Scientific	23-017-015	frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.164323 1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
L-Glutamine	Fisher Scientific	25-030-081	frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control	Horizon	CN-001000-01-50	reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic	Horizon	C-310564-05-0050	reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 Supplement	Fisher Scientific	17-502-048	frozen aliquots
Neurobasal Medium	Fisher Scientific	21-103-049	used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical	LK003153	reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific	15-140-122	frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P4538-50MG	reconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF Protein	R&D Systems	248-BDB-050/CF	reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF Protein	Fisher Scientific	2028EG200	reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF Protein	Fisher Scientific	512GF010	reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	712-296-150	dilution 1:1,000
Slide Mounting Medium	Fisher Scientific	OB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)	Fisher Scientific	L3000015	store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)	Eppendorf	2231300008
Disposable Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12	Fisher Scientific	08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24	Fisher Scientific	08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets	Fisher Scientific	13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets	Fisher Scientific	13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets	Fisher Scientific	13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam Gloves	Fisher Scientific	19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness)	Fisher Scientific	22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm	Fisher Scientific	09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinet	Thermo Scientific	1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810	Keyence	9011800000
Binocular Zoom Stereo Microscope	Vision Scientific	VS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)	VWR	25384-088
Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium	Fine Science Tools	11252-40
Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox	Fine Science Tools	11255-20
Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium	Fine Science Tools	11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 R	Eppendorf	2231000508
Fine Scissors-sharp	Fine Science Tools	14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cm	World Precision Instruments	14124
Metal bead bath	Lab Armor	74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm	VWR	82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)	Living Systems Instrumentation	DD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5	World Precision Instruments	501979
Water Jacketed CO2 Incubator	VWR	10810-744