Culturas celulares primárias para estudar o potencial de regeneração de Murine Müller Glia após tratamento de MicroRNA

Summary

As culturas primárias de Müller glia obtidas a partir de retinas de camundongos representam uma ferramenta muito robusta e confiável para estudar a conversão gliaial em células progenitoras de retina após o tratamento de microRNA. Moléculas ou combinações únicas podem ser testadas antes de sua subsequente aplicação de abordagens in vivo .

Abstract

Müller glia (MG) é a glia predominante na retina neural e pode funcionar como fonte regenerativa para neurônios da retina. Em vertebrados inferiores, como peixes, a regeneração orientada por MG ocorre naturalmente; em mamíferos, no entanto, é necessária estimulação com certos fatores ou manipulação genética/epigenética. Como a MG compreende apenas 5% da população de células da retina, há necessidade de sistemas de modelo que permitam o estudo dessa população celular exclusivamente. Um desses sistemas de modelo são culturas primárias de MG que são reprodutíveis e podem ser usadas para uma variedade de aplicações, incluindo triagem e identificação de moléculas/fatores, testes de compostos ou fatores, monitoramento celular e/ou testes funcionais. Este modelo é usado para estudar o potencial de mamão murina para converter em neurônios de retina após suplementação ou inibição de microRNAs (miRNAs) via transfecção de miRNAs artificiais ou seus inibidores. O uso de camundongos repórteres específicos de MG em combinação com rotulagem imunofluorescente e sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) confirmou que 80%-90% das células encontradas nessas culturas são MG. Usando este modelo, descobriu-se que miRNAs podem reprogramar MG em células progenitoras de retina (RPCs), que posteriormente se diferenciam em células neuronais. As vantagens dessa técnica são que os candidatos do miRNA podem ser testados para sua eficiência e resultado antes de seu uso em aplicações in vivo .

Introduction

A glia Müller (MG) é a glia predominante na retina neural. Eles têm funções semelhantes em comparação com outras glia em outras partes do sistema nervoso central, como manter a água e a homeostase de íon, nutrir neurônios e proteger o tecido. Mg tem outra característica fascinante: embora sejam glia maduras, elas ainda expressam muitos genes expressos em células progenitoras de retina (RPCs) durante o desenvolvimento tardio ^1,2. Essa semelhança é considerada a razão para a regeneração neuronal baseada em MG na retina do peixe após danos na retina ^3,4. Durante esse processo, a MG reentra no ciclo celular e se desfastou em RPCs que, em seguida, se diferenciam em todos os seis tipos de neurônios da retina. Embora este fenômeno ocorra naturalmente em peixes, os mamíferos MG não se convertem em neurônios ^5,6. Eles podem, no entanto, ser reprogramados. Uma variedade de fatores tem sido mostrado para reprogramar MG em RPCs/neurônios; entre esses fatores está o fator básico de transcrição helix-loop-helix (bHLH) que está envolvido na regeneração de ^{peixes 7,8}. Em camundongos, Ascl1 só é expresso em RPCs durante a retinogênese, mas está ausente em MG maduro ou neurônios de retina⁹.

A reprogramação de células diretamente in vivo não só é metodologicamente desafiadora, mas também requer a aprovação de um comitê institucional de cuidados e uso de animais. Para receber aprovação, são necessários dados preliminares sobre os fatores usados ou alterados, concentrações, efeitos fora do alvo, mecanismos subjacentes, toxicidade e eficiência. Os sistemas de cultura celular permitem testes para esses critérios antes do uso em modelos in vivo. Além disso, como MG compreende apenas cerca de 5% de toda a população de células da retina¹⁰, as culturas de MG permitem o estudo de sua função¹¹, bem como seu comportamento, incluindo migração^12,13, proliferação¹⁴, reação de estresse a lesões/danos^15,16, sua interação com outros tipos celulares como microglia¹⁷ ou células de gânglios de retina (RGCs)¹⁸, ou seu potencial neurogênico 19,20,21. Muitos pesquisadores usam linhas celulares imortalizadas para seus estudos, pois têm um potencial proliferativo ilimitado e podem ser facilmente mantidas e transfetizadas. As células primárias, no entanto, são preferíveis para ensaios biologicamente relevantes do que células imortalizadas, pois possuem características celulares verdadeiras (expressão genética e proteica) e, mais importante, representam um certo estágio no desenvolvimento e, portanto, têm uma “idade”. A idade de um animal (e consequentemente das células obtidas de um animal) é um fator especialmente crucial na reprogramação celular, uma vez que a plasticidade celular reduz com o estágio de desenvolvimento^{progredido 22}.

Este protocolo descreve em detalhes como reprogramar MG primário com miRNAs como um método in vitro atual para estudar a regeneração. Este modelo de cultura primária de MG foi criado em 2012 para avaliar as características de proliferação celular de MG em camundongos knock-out P53 (trp53-/- camundongos)²³. Mostrou-se que mg cultivados mantêm suas características gliais (ou seja, expressão de proteínas S100β, Pax6 e Sox2 avaliadas via rotulagem imunofluorescente), e que se assemelham a in vivo MG (microarray de FACS-purificado MG)²³. Pouco depois, mRNA glial e expressão proteica foram validados e confirmados em uma abordagem diferente utilizando vetores virais²⁰. Alguns anos depois, foi confirmado que a grande maioria das células encontradas nessas culturas são MG usando o Rlbp1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl reporter mouse²⁴. Além disso, a quantificação do conjunto de miRNAs tanto em MG purificada facs quanto em MG primária cultivada mostrou que os níveis de MG miRNAs (mGLiomiRs) não variam muito em MG cultivada durante a fase de crescimento. Períodos de cultura alongados, no entanto, causam alterações nos níveis de miRNA e, consequentemente, nos níveis de mRNA e expressão proteica, uma vez que os miRNAs são reguladores translacionais²⁵.

Em 2013, este modelo de cultura mg foi utilizado para testar uma variedade de fatores de transcrição no que diz respeito à sua capacidade de reprogramar MG em neurônios^{retinais 20}. O Ascl1 foi considerado um fator de reprogramação muito robusto e confiável. A superexpressão de Ascl1 através de vetores virais induziu alterações morfológicas, expressão de marcadores neuronais e aquisição de propriedades eletrofisiológicas neuronais. Mais importante, os insights e resultados obtidos a partir desses primeiros experimentos in vitro foram transferidos com sucesso para aplicações in vivo ^22,26 demonstrando que as culturas primárias de MG representam uma ferramenta sólida e confiável para triagens iniciais de fatores e avaliação de recursos gliais antes da implementação in vivo.

Alguns anos atrás, foi mostrado que o miRNA miR-124 enriquecido pelo cérebro, que também é altamente expresso em neurônios da retina, pode induzir a expressão Ascl1 em MG²¹ cultivada. A expressão ascl1 em células vivas foi visualizada através de um rato repórter Ascl1 (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl). Um rato repórter é um rato geneticamente modificado que tem um gene repórter inserido em seu DNA. Este gene repórter codifica uma proteína repórter, que está neste estudo tdTomato, uma proteína fluorescente vermelha. Esta proteína repórter relata a expressão de um gene de interesse, neste caso, Ascl1. Em outras palavras, as células que expressam Ascl1 ficarão vermelhas. Uma vez que o Ascl1 é expresso apenas em RPCs⁹, este rato Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl permite o rastreamento da conversão de MG em RPCs expressos ascl1 , o que significa que as células de conversão expressarão proteína de repórter tdTomato fluorescente vermelho. Esta é uma rotulagem irreversível, já que o DNA dessas células é alterado. Consequentemente, qualquer diferenciação neuronal subsequente será visualizada porque o rótulo tdTomato permanece em células diferenciadoras. Se ascl1 expressando RPCs derivados de MG (com rótulo tdTomato) se diferenciarem em neurônios, esses neurônios ainda terão seu rótulo vermelho. Este mouse, portanto, permite não apenas a rotulagem de RPCs derivados de MG para imagens de células vivas, mas também permite mapeamento de destino e rastreamento de linhagem desses RPCs derivados de MG (vermelho). Mais recentemente, o conjunto de miRNAs em RPCs foi identificado e as culturas mg de ratos Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl RPC-reporter foram usadas para tela e teste o efeito desses miRNAs na capacidade de reprogramação e eficiência²⁷. Um candidato, o RPC-miRNA miR-25, foi encontrado capaz de reprogramar MG cultivado em células expressantes Ascl1 (Ascl1-Tomate+). Essas células reprogramadas adotam características neuronais ao longo do tempo, incluindo morfologia neuronal (pequeno somata e processos finos curtos ou longos), expressão de transcrições neuronais medidas via scRNA-Seq, bem como expressão de proteínas neuronais validadas via rotulagem imunofluorescente²⁷.

Aqui, o protocolo detalha como crescer e transfectar MG a partir de camundongos P12 adaptados do trabalho anterior 21,24,27. Escolhido para este protocolo é o miRNA miR-25 acima mencionado, um miRNA altamente expresso em RPCs, com baixos níveis de expressão em MG ou neurônios de retina. Para superexpressar o miR-25, são utilizadas mímicas de murine miR-25, ou seja, moléculas artificiais de miRNA. Como controle, são escolhidas imitações de um miRNA de caenorhabditis elegans, que não têm função em células de mamíferos. A visualização da conversão de MG em RPCs foi realizada através do mouse repórter RPC (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl), um mouse com fundo misto (cepas C57BL/6, S129 e ICR). Essa cultura pode, no entanto, ser realizada com todas as cepas de camundongos, incluindo cepas do tipo selvagem. Nos últimos anos, o protocolo original foi modificado para reduzir a duração da fase de crescimento e o período de cultura geral e garantir um status celular glia mais robusto e minimizar o grau de degeneração celular, que ocorre em períodos de cultura prolongada. O horário regular de transfecção também foi estendido de 3h para 2 dias. Como mencionado anteriormente, embora o protocolo atual descreva as culturas de MG como uma ferramenta para estudos de regeneração, o método não é apenas útil para testar fatores de reprogramação, mas também pode ser adaptado para outras aplicações, incluindo estudos sobre comportamento migratório ou proliferativo de MG, paradigmas relacionados a lesões/danos celulares e/ou a identificação de mecanismos e caminhos subjacentes.

Protocol

Os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade suny de Optometria. NOTA: Este protocolo de cultura consiste em três fases: crescimento, transfecção e fase de conversão. Um resumo do protocolo geral com o cronograma é dado na Figura 1. 1. Preparação de mídia e todos os reagentes necessários NOTA:…

Representative Results

Este protocolo descreve como cultivar MG a partir de retinas de camundongos P12 e como reprogramar essas células com miR-25 em neurônios de retina usando o rato repórter Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Este método foi utilizado em trabalhos anteriores relatando em detalhes outros miRNAs adequados (imitadores ou inibidores, como moléculas únicas ou em combinação) para reprogramar MG em RPC que, em seguida, adotam características celulares neuronais27. Este…

Discussion

Este protocolo descreve como cultivar MG a partir de retinas de camundongos dissociados para estudos de reprogramação usando miRNAs. Como mostrado e confirmado em uma variedade de estudos anteriores, a grande maioria (80%-90%) das células encontradas nessas culturas são MG 20,23,24. Este método é uma técnica muito robusta e confiável e os resultados podem ser facilmente reproduzidos se o protocolo for seguido corretament…

Materials

Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J	Jax laboratories	#012882	Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J	Jax laboratories	#007914	Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer	Sigma-Aldrich	H7904-5MG	reconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution	VWR	100504-782	2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-546-152	dilution 1:500
Alexa Fluor 647 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	705-606-147	dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems	Fisher Scientific	AF1979	dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M9942-200UL	dilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody	Antibodies-Online	ABIN334653	dilution 1:500
Ascorbic Acid	STEMCELL Technologies	72132	reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 Supplement	Fisher Scientific	17-504-044	frozen aliquots
Brain Phys Neuronal Medium	STEMCELL Technologies	05790	used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit	Fisher Scientific	C10340	reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMP	STEMCELL Technologies	73886	reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	MT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35010CV	frozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement	Fisher Scientific	51-985-034	store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Fisher Scientific	12-605-028	used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSS	Fisher Scientific	14-025-134	store at 4 °C
Laminin mouse protein, natural	Fisher Scientific	23-017-015	frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.164323 1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
L-Glutamine	Fisher Scientific	25-030-081	frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control	Horizon	CN-001000-01-50	reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic	Horizon	C-310564-05-0050	reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 Supplement	Fisher Scientific	17-502-048	frozen aliquots
Neurobasal Medium	Fisher Scientific	21-103-049	used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical	LK003153	reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin Streptomycin	Fisher Scientific	15-140-122	frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P4538-50MG	reconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF Protein	R&D Systems	248-BDB-050/CF	reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF Protein	Fisher Scientific	2028EG200	reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF Protein	Fisher Scientific	512GF010	reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 – AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	712-296-150	dilution 1:1,000
Slide Mounting Medium	Fisher Scientific	OB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)	Fisher Scientific	L3000015	store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette Tips	Fisher Scientific	02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)	Eppendorf	2231300008
Disposable Transfer Pipets	Fisher Scientific	13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12	Fisher Scientific	08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24	Fisher Scientific	08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets	Fisher Scientific	13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets	Fisher Scientific	13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets	Fisher Scientific	13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam Gloves	Fisher Scientific	19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 – 0.25 mm thickness)	Fisher Scientific	22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm	Fisher Scientific	09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinet	Thermo Scientific	1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810	Keyence	9011800000
Binocular Zoom Stereo Microscope	Vision Scientific	VS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)	VWR	25384-088
Dumont #5 Forceps – Biologie/Titanium	Fine Science Tools	11252-40
Dumont #55 Forceps – Biologie/Inox	Fine Science Tools	11255-20
Dumont #7 curved Forceps – Biologie/Titanium	Fine Science Tools	11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 R	Eppendorf	2231000508
Fine Scissors-sharp	Fine Science Tools	14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cm	World Precision Instruments	14124
Metal bead bath	Lab Armor	74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm	VWR	82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)	Living Systems Instrumentation	DD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5	World Precision Instruments	501979
Water Jacketed CO2 Incubator	VWR	10810-744