Profilazione a livello di genoma delle interazioni di legame tra fattore di trascrizione e DNA in Candida albicans: un metodo CUT&RUN completo e un flusso di lavoro di analisi dei dati
Summary
Questo protocollo descrive un metodo sperimentale e un flusso di lavoro di analisi dei dati per la scissione sotto bersagli e il rilascio utilizzando la nucleasi (CUT & RUN) nel patogeno fungino umano Candida albicans.
Abstract
I fattori di trascrizione regolatori controllano molti importanti processi biologici, tra cui la differenziazione cellulare, le risposte alle perturbazioni e agli stress ambientali e le interazioni ospite-patogeno. Determinare il legame genome-wide dei fattori di trascrizione regolatori al DNA è essenziale per comprendere la funzione dei fattori di trascrizione in questi processi biologici spesso complessi. La scissione sotto bersagli e il rilascio mediante nucleasi (CUT&RUN) è un metodo moderno per la mappatura a livello di genoma delle interazioni di legame proteina-DNA in vivo che è un’alternativa interessante all’immunoprecipitazione della cromatina tradizionale e ampiamente utilizzata seguita dal metodo di sequenziamento (ChIP-seq). CUT&RUN è suscettibile di una configurazione sperimentale a throughput più elevato e ha una gamma dinamica sostanzialmente più elevata con costi di sequenziamento per campione inferiori rispetto a ChIP-seq. Qui, vengono descritti un protocollo CUT&RUN completo e un flusso di lavoro di analisi dei dati di accompagnamento su misura per l’analisi a livello di genoma delle interazioni di legame tra fattore di trascrizione e DNA nel patogeno fungino umano Candida albicans . Questo protocollo dettagliato include tutte le procedure sperimentali necessarie, dall’epitopo tagging dei geni codificanti il fattore di trascrizione alla preparazione della libreria per il sequenziamento; inoltre, include un flusso di lavoro computazionale personalizzato per l’analisi dei dati CUT&RUN.
Introduction
La Candida albicans è un patogeno fungino umano polimorfico clinicamente rilevante che esiste in una varietà di diverse modalità di crescita, come la modalità di crescita planctonica (fluttuante) e come comunità di cellule strettamente aderenti protette da una matrice extracellulare, nota come modalità di crescita del biofilm 1,2,3. Simile ad altri processi di sviluppo e cellulari, lo sviluppo del biofilm è un importante tratto di virulenza di C. albicans che è noto per essere controllato a livello trascrizionale da fattori di trascrizione regolatori (TF) che si legano al DNA in modo specifico per sequenza4. Recentemente, i regolatori della cromatina e i modificatori degli istoni sono emersi anche come importanti regolatori della formazione del biofilm di C. albicans 5 e della morfogenesi6 mediando l’accessibilità del DNA. Per comprendere la complessa biologia di questo importante agente patogeno fungino, sono preziosi metodi efficaci per determinare la localizzazione a livello di genoma di specifici TF durante distinti processi di sviluppo e cellulari.
L’immunoprecipitazione della cromatina seguita dal sequenziamento (ChIP-seq) è un metodo ampiamente utilizzato per studiare le interazioni proteina-DNA in C. albicans 5,6 e ha ampiamente sostituito la più classica immunoprecipitazione della cromatina seguita dal metodo microarray (ChIP-chip)9. Entrambi i metodi ChIP-seq e ChIP-chip, tuttavia, richiedono un gran numero di cellule di input10, che può essere un fattore di complicazione quando si studiano i TF nel contesto di campioni specifici e modalità di crescita, come biofilm raccolti da pazienti o modelli animali di infezione. Inoltre, il test di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) spesso produce una quantità significativa di segnale di fondo in tutto il genoma, richiedendo un alto livello di arricchimento per il bersaglio di interesse per separare sufficientemente il segnale dal rumore. Mentre il test ChIP-chip è in gran parte obsoleto oggi, le profondità di sequenziamento necessarie per ChIP-seq rendono questo test proibitivo per molti ricercatori, in particolare quelli che studiano più TF e / o proteine associate alla cromatina.
La scissione sotto bersagli e il rilascio utilizzando la nucleasi (CUT&RUN) è un’alternativa interessante a ChIP-seq. È stato sviluppato dal laboratorio Henikoff nel 2017 per aggirare le limitazioni della scissione endogena di ChIP-seq e cromatina seguita dal sequenziamento di ChEC-seq11,12, un altro metodo per identificare le interazioni proteina-DNA a livello di genoma, fornendo al contempo una mappatura ad alta risoluzione a livello di genoma di TF e proteine associate alla cromatina13 . CUT&RUN si basa sulla digestione mirata della cromatina all’interno di nuclei permeabilizzati utilizzando nucleasi micrococciche legate, seguita dal sequenziamento dei frammenti di DNA digeriti 9,10. Poiché i frammenti di DNA sono specificamente generati nei loci che sono legati da una proteina di interesse, piuttosto che essere generati in tutto il genoma tramite frammentazione casuale come nei saggi ChIP, l’approccio CUT&RUN si traduce in segnali di fondo notevolmente ridotti e, quindi, richiede 1/10 della profondità di sequenziamento rispetto a ChIP-seq11,13, 14. Questi miglioramenti alla fine portano a significative riduzioni dei costi di sequenziamento e riduzioni del numero totale di celle di input necessarie come materiale di partenza per ciascun campione.
Qui, viene descritto un robusto protocollo CUT&RUN che è stato adattato e ottimizzato per determinare la localizzazione a livello di genoma di TF in cellule C. albicans isolate da biofilm e colture planctoniche. Viene inoltre presentata una pipeline di analisi dei dati approfondita, che consente l’elaborazione e l’analisi dei dati di sequenza risultanti e richiede agli utenti di avere un’esperienza minima nella codifica o nella bioinformatica. In breve, questo protocollo descrive l’epitopo tagging di geni codificanti TF, la raccolta di biofilm e cellule planctoniche, l’isolamento di nuclei permeabilizzati intatti, l’incubazione con anticorpi primari contro la proteina specifica o la proteina marcata con epitopi di interesse, il tethering delle proteine di fusione chimerica A/G-micrococcica (pAG-MNasi) agli anticorpi primari, il recupero del DNA genomico dopo la digestione della cromatina e la preparazione di librerie di DNA genomico per il sequenziamento.
Il protocollo sperimentale CUT&RUN è seguito da una pipeline di analisi dei dati appositamente costruita, che prende le letture del sequenziamento del DNA grezzo in formato FASTQ e implementa tutte le fasi di elaborazione necessarie per fornire un elenco completo di loci significativamente arricchiti legati dal TF di interesse (mirato dall’anticorpo primario). Si noti che più passaggi del protocollo di preparazione della libreria descritto sono stati specificamente adattati e ottimizzati per l’analisi CUT&RUN dei TF (al contrario dei nucleosomi). Mentre i dati presentati in questo manoscritto sono stati generati utilizzando adattamenti specifici per TF di un kit COMMERCIALE CUT & RUN, questi protocolli sono stati anche convalidati utilizzando componenti di provenienza individuale (ad esempio, enzima pAG-MNasi e perle di purificazione del DNA magnetico) e tamponi preparati internamente, che possono ridurre significativamente i costi sperimentali. I protocolli sperimentali e di analisi dei dati completi sono descritti in dettaglio di seguito in un formato passo-passo. Tutti i reagenti e le apparecchiature critiche, nonché le ricette tampone e di supporto, sono elencati rispettivamente nella Tabella dei materiali e nel File supplementare 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo presenta una pipeline sperimentale e computazionale completa per la localizzazione a livello di genoma di TF regolatori in C. albicans. È progettato per essere altamente accessibile a chiunque abbia una formazione standard in microbiologia e biologia molecolare. Sfruttando l’elevata gamma dinamica e i bassi requisiti di input del campione del test CUT&RUN e includendo ottimizzazioni per la localizzazione delle interazioni di legame TF-DNA nel biofilm di C. albicans e nelle colture pla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo tutti i membri passati e presenti dei laboratori Nobile ed Hernday per il feedback sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) numero di premio R35GM124594 e dalla famiglia Kamangar sotto forma di una cattedra dotata di C.J.N. Questo lavoro è stato supportato anche dal numero di premio del NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) R15AI137975 ad A.D.H.C.L.E. è stato supportato dal numero di borsa di studio del NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) F31DE028488. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta le opinioni dei finanziatori. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, analisi o interpretazione dei dati; nella stesura del manoscritto; o nella decisione di pubblicare i risultati.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
| 0.65 mL low-adhesion tubes | VWR | 490003-190 | |
| 1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
| 1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
| 12-well untreated cell culture plates | Corning | 351143 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| 2% Digitonin | Fisher Scientific | CHR103MI | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| 5x phusion HF buffer | Fisher Scientific | F530S | Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer" |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent |
| Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
| Bacto peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Benchling primer design tool | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool" | |
| Betaine | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
| Calcofluor white stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| Candida Genome Database | http://www.candidagenome.org/ | ||
| Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads | Polysciences | 86057-3 | |
| Conda software | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
| curl tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| CUTANA ChIC/CUT&RUN kit | Epicypher | 14-1048 | Referred to in the text as "the CUT&RUN kit" |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | New England Biolabs | N0447S | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Difco D-mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Fisher Scientific | R0611 | |
| DreamTaq green DNA polymerase | Fisher Scientific | EP0713 | Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase" |
| DreamTaq green DNA polymerase buffer | Fisher Scientific | EP0713 | Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer" |
| E. coli spike-in DNA | Epicypher | 18-1401 | |
| ELMI Microplate incubator | ELMI | TRMS-04 | Referred to in the text as "microplate incubator" |
| End Prep Enzyme Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| End Prep Reaction Buffer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Ethanol 200 proof | VWR | 89125-170 | |
| FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | Referred to in the text as "restriction enzyme" |
| FastDigest MssI Buffer | Fisher Scientific | FD1344 | Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer" |
| Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
| Fluorescence microscope | User-dependent | ||
| Gel electrophoresis apparatus | User-dependent | ||
| GeneRuler low range DNA ladder | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
| GitBash workflow | https://gitforwindows.org/ | ||
| GitHub source code | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
| HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
| High-speed centrifuge | User-dependent | ||
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
| Lens paper | VWR | 52846-001 | |
| Ligation Enhancer | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | ||
| Lithium acetate dihydrate | MP Biomedicals | 215525683 | |
| Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody | Takara | 632592 | User-dependent |
| MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
| Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes | Epicypher | 10-0008 | |
| Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes | Fisher Scientific | MR02 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microplate and cuvette spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent |
| MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| NaCl | VWR | 470302-522 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
| NEBNext Adaptor for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter" | ||
| NEBNext Index X Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer" | ||
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit | New England Biolabs | E7645S | Referred to in the text as "library prep kit" |
| NEBNext Universal PCR Primer for Illumina | Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer" | ||
| Nourseothricin sulfate (NAT) | Goldbio | N-500-2 | |
| Novex TBE Gels, 10%, 15 well | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | |
| Nutrient broth | Criterion | C6471 | |
| pADH110 | Addgene | 90982 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982" |
| pADH119 | Addgene | 90985 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985" |
| pADH137 | Addgene | 90986 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986" |
| pADH139 | Addgene | 90987 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987" |
| pADH140 | Addgene | 90988 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988" |
| pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 or 15-1116 | 50 rxn or 250 rxn |
| pCE1 | Addgene | 174434 | Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434" |
| Petri dishes with clear lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Fisher Scientific | F530S | Referred to in the text as "DNA polymerase" |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | VWR | 10791-816 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Qubit 1x dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q33230 | |
| Qubit fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent |
| Rabbit IgG negative control antibody | Epicypher | 13-0042 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
| Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Shaking incubator | Eppendorf | M12820004 | User-dependent |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
| Spin-X centrifuge tube filters | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
| Sterile inoculating loops | VWR | 30002-094 | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Fisher Scientific | S11494 | |
| SYTO 13 nucleic acid stain | Fisher Scientific | S7575 | Referred to in the text as "nucleic acid gel stain" |
| Thermocycler | User-dependent | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
| Ultra II Ligation Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix" | ||
| Ultra II Q5 Master Mix | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix " | ||
| UltraPure salmon sperm DNA solution | Invitrogen | 15632011 | |
| USER Enzyme | Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme" | ||
| Vortex mixer | VWR | 10153-834 | |
| wget tool | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz |
||
| Yeast extract | Criterion | C7341 | |
| Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) | Fisher Scientific | NC0439194 |
References
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).
- Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).
- Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682 (2021).
- Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
- Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
- Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
- Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).
- Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
- Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).
- Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
- Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49 (2010).
- Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).
- Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).
