Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide d’un modèle transgénique de poisson-zèbre. L’adaptation du protocole pour incorporer la modulation de la voie de signalisation à l’aide de composés pharmacologiques est très détaillée. Une plate-forme MATLAB pour quantifier la régénération RPE basée sur la pigmentation a été développée et est présentée et discutée.
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Article de méthode
Ablation médiée par la nitroréductase/métronidazole et une plate-forme MATLAB (RpEGEN) pour l’étude de la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) réside à l’arrière de l’œil et remplit des fonctions essentielles au maintien de la santé et de l’intégrité des tissus rétiniens et vasculaires adjacents. À l’heure actuelle, la capacité réparatrice limitée de l’EPR des mammifères, qui se limite aux petites blessures, a entravé les progrès dans la compréhension des processus de régénération de l’EPR in vivo . Ici, une méthodologie détaillée est fournie pour faciliter l’étude de la réparation in vivo de l’EPR à l’aide du poisson-zèbre, un modèle de vertébré capable d’une régénération tissulaire robuste. Ce protocole décrit un paradigme de lésion transgénique médié par la nitroréductase / métronidazole (NTR / MTZ) (rpe65a: nfsB-eGFP), qui entraîne l’ablation des deux tiers centraux de l’EPR après un traitement de 24 heures par MTZ, avec récupération tissulaire ultérieure. L’accent est mis sur les ablations de l’EPR chez les larves de poisson-zèbre et les méthodes de test des effets des composés pharmacologiques sur la régénération de l’EPR sont également décrites. La génération et la validation de RpEGEN, un script MATLAB créé pour automatiser la quantification de la régénération RPE basée sur la pigmentation, sont également abordées. Au-delà des mécanismes actifs de réparation de l’EPR, ce protocole peut être étendu aux études de la dégénérescence de l’EPR et des réponses aux blessures, ainsi que des effets des lésions de l’EPR sur les tissus rétiniens et vasculaires adjacents, entre autres processus cellulaires et moléculaires. Ce système de poisson-zèbre est très prometteur dans l’identification des gènes, des réseaux et des processus qui stimulent la régénération de l’EPR et les mécanismes liés à la maladie de l’EPR, dans le but à long terme d’appliquer ces connaissances aux systèmes mammifères et, en fin de compte, au développement thérapeutique.
Introduction
La méthodologie décrite ici détaille un protocole pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide de larves de poisson-zèbre. L’EPR s’étend sur l’arrière de l’œil et réside entre les couches stratifiées de la rétine neurale et la couche de vascularisation constituant la choroïde. Le soutien trophique, l’absorption de la lumière phototoxique et le maintien des protéines du cycle visuel ne sont que quelques-unes des fonctions critiques de l’EPR qui sont essentielles au maintien de la santé et de l’intégrité de ces tissus adjacents1. Les dommages causés à l’EPR chez les mammifères sont réparables lorsque les lésions son....
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Protocole
Toutes les méthodologies décrites dans le présent document sont conformes à l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Pittsburgh.
1. Préparation avant la collecte d’embryons de poisson zèbre
- Réglez l’incubateur d’embryons à 28,5 °C.
- Préparer une solution mère 25x de l’inhibiteur de la mélanogenèse, la N-phénylthiourée (PTU)21,22. Cette solution mère est mise à l’échelle à partir d’une recette commune22 et 1x est égale à 0,003% de poids par volume (% p / v) (par exemple, 0,003 g de po....
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Résultats
L’inhibition de la voie canonique de signalisation Wnt est connue pour nuire de manière significative à la régénération de l’EPR du poisson-zèbre en utilisant le paradigme d’ablation génétique (rpe65a:nfsB-eGFP) et la méthodologie de manipulation pharmacologique (IWR-1) décrite dans le protocole3. Cette expérience a été répétée ici pour valider une méthode automatisée de quantification de la régénération RPE du poisson-zèbre basée sur la pigmentation. Les résultats résumés ci-dessous engl.......
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Discussion
Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’EPR et étudie les mécanismes de dégénérescence et de régénération chez les poissons-zèbres d’âge larvaire. Ce protocole a également été réalisé avec succès chez le poisson-zèbre adulte3, mais avec une caractérisation moins étendue, c’est pourquoi les larves sont au centre de l’attention ici. Les aspects critiques de cette partie du protocole (étapes 1 à 4) comprennent: 1) l’ajout de 1,5x PTU aux embryons avant le début de la mélanoge.......
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Déclarations de divulgation
L.L.L. est le co-inventeur du brevet américain n° 9 458 428, qui décrit une méthode accélérée pour dériver l’épithélium pigmentaire rétinien à partir de cellules souches pluripotentes humaines; cela n’a aucun rapport avec le contenu des présentes. J.M.G. et G.B.F. n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les travaux décrits ici ont été soutenus par les National Institutes of Health (RO1-EY29410 à J.M.G, et NIH CORE Grant P30-EY08098 au Département d’ophtalmologie); le Centre de transplantation immunitaire et de thérapie upMC (à L.L.L. et J.M.G.); et la Chaire E. Ronald Salvitti en recherche en ophtalmologie (à J.M.G.). Un soutien supplémentaire a été reçu de la bourse Wiegand en ophtalmologie (à L.L.L), de la Fondation Eye & Ear de Pittsburgh et d’une subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness, New York, NY. Les auteurs tiennent également à remercier Amanda Platt pour son aide technique et le Dr Hugh Hammer et le personnel aquatique pour l’excellent ....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lab Matériel/Équipement | |||
| -(4-Amidinophényl)-6-chlorhydrate d’indolecarbamidine (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
| Plaques à 6 puits | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Tubes à centrifuger coniques en polypropylène | Fisher Scientific | 05-539-13 | Le numéro de catalogue est pour les tubes de 50 mL |
| Stylo de traçage à pointe de diamant | Fisher Scientific | 50-254-51 | Fabriqué par Electron Microscopy Sciences, les articles similaires à ce numéro de pièce sont adéquats |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) &ge ; 99.7 % | Fisher Scientific | BP231 | Vérifier les exigences d’élimination des déchets chimiques de l’institut |
| Incubateur d’embryons (grand) | Fisher Scientific | 3720A | |
| Incubateur d’embryons (mini/de table) | Labnet | I5110A | |
| Stéréomicroscope à fluorescence | Zeiss | Axio Zoom.V16 | Ou similaire, avec laser/filtre d’excitation 488 nm |
| Pipette Pasteur en verre | Fisher Scientific | 13-678-4 | Fabriqué par Corning, InSolution |
| Wnt Antagonist I non stérile, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Fabriqué par Calbiochem ; 25 mM dans DMSO ; vérifier les exigences d’élimination des déchets chimiques internes |
| Bleu de méthylène (poudre) | Fisher Scientific | BP117-100 | Également disponible en tant que solution |
| aqeuous préfabriquéeMétronidazole (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Vérifier les exigences institutionnelles en matière d’élimination des déchets chimiques |
| N-phénylthiourée (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Vérifier les exigences internationales en matière d’élimination des déchets chimiques |
| Paraformaldéhyde (16 % p/v) Sans méthanol | Fisher Scientific | AA433689M | Déchets chimiques, élimination appropriée requise |
| Boîtes de Pétri | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| saline tamponnée au phosphate de 10 cm de diamètre (sachets de poudre) | Millipore Sigma | P3813 | Utilisé pour fabriquer 10 X stock PBS |
| Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
| Incubateur à secousses | Benchmark | H2010 | Utilisé pour l’incubation de MTZ pendant 1 heure à 37 degrés Celsius |
| Stéréomicroscope | Leica | S9i | Ou similaire, avec lumière transmise Pince |
| d’éclairage Student Dumont #5 | Outils de science fine | 91150-20 | Pince à pointe fine pour la déchorisation manuelle |
| Rotateur/agitateur de table | Scilogex | SK-D1807-E | |
| Pipette de transfert | Millipore Sigma | Z135003 | 3,2 mL à tirage d’ampoule, non stérile |
| Méthanesulfonate de tricaïne (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Également disponible auprès de Fisher Scientific (NC0342409) |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium avec DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Software Material | |||
| FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Version : 2.0.0-rc-69/1.52p ; Construction : 269a0ad53f ; Plugin nécessaire : Bio-Formats |
| GRAMM exemples et tutoriels | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes nécessaires à l’exécution de RpEGEN : Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox |
| MATLAB prend en charge | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |
Références
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
- Hanovice, N. J., et al.
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Réimpressions et autorisations
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