מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים
Summary
מתואר פרוטוקול המשתמש במיקרו-דיסקציה של לייזר כדי לבודד רקמות נמטודה בודדות לריצוף RNA. הפרוטוקול אינו דורש ערכות כלים גנטיות ספציפיות למינים, מה שמאפשר להשוות פרופילי ביטוי גנים בין מינים שונים ברמה של דגימות של רקמה אחת.
Abstract
מתודולוגיות של תאים בודדים חוללו מהפכה בניתוח של תעתיקים של סוגי תאים ספציפיים. עם זאת, לעתים קרובות הם דורשים “ערכות כלים” גנטיות ספציפיות למין, כגון מקדמים המניעים ביטוי ספציפי לרקמות של חלבונים פלואורסצנטיים. יתר על כן, פרוטוקולים המשבשים רקמות כדי לבודד תאים בודדים מסירים תאים מהסביבה הטבעית שלהם (למשל, איתות משכנים) ועלולים לגרום לתגובות עקה או להבדלים אחרים ממצבי ביטוי גנים מקומיים. בפרוטוקול הנוכחי, מיקרו-דיסקציה של לייזר (LMD) מותאמת לבידוד קצוות זנב נמטודות בודדות לחקר ביטוי גנים במהלך מורפוגנזה של קצה הזנב הזכרי.
LMD מאפשר בידוד של חלק מבעל החיים ללא צורך בהפרעה תאית או בערכות כלים ספציפיות למין ולכן הוא ישים לכל מין. לאחר מכן, ניתן ליישם פרוטוקולי הכנה של ספריית RNA-seq חד-תאיים כגון CEL-Seq2 על רקמות בודדות מבודדות LMD ולנתח אותם באמצעות צינורות סטנדרטיים, בהתחשב בכך שגנום מבואר היטב או תעתיק זמין עבור המין. נתונים כאלה יכולים לשמש כדי לקבוע עד כמה השעתוקים נשמרים או שונים הם העומדים בבסיס ההתפתחות של אותה רקמה במינים שונים.
המגבלות כוללות את היכולת לחתוך את הרקמה המעניינת ואת גודל המדגם. ניתוח הספק מראה כי רק 70 קצוות זנב לכל מצב נדרשים עבור 80% כוח. יש צורך בסנכרון הדוק של ההתפתחות כדי להשיג מספר זה של בעלי חיים באותו שלב התפתחותי. לפיכך, מתוארת גם שיטה לסנכרון בעלי חיים במרווחים של שעה אחת.
Introduction
נמטודות – במיוחד הנמטודות הרבדיות הקשורות למערכת המודל Caenorhabditis elegans – הן קבוצה נפלאה של בעלי חיים לביולוגיה התפתחותית אבולוציונית (EDB) מסיבות רבות 1,2. היתרונות כוללים את מספרם הקטן של התאים, שושלות תאים מוגדרות ועקביות, שקיפות וקלות התרבית והתרבית. ישנם גם משאבים רבים זמינים, כולל גנומים באיכות גבוהה עבור מינים רבים, ועבור C. elegans, כלים גנטיים מולקולריים נרחבים וידע על התפתחות, גנטיקה, אנטומיה ופיזיולוגיה 3,4,5,6.
כמו באורגניזמים רבים אחרים, היכולת לאפיין את דינמיקת השעתוק ברקמות בודדות או בתאים בודדים חוללה מהפכה בניתוח ההתפתחות ב– C. elegans 7,8,9,10. היכולת להשוות תעתיקים של תאים בודדים על פני נמטודות תשנה באופן דומה את EDB באמצעות אורגניזמים אלה. לדוגמה, השוואות כאלה יספקו תובנה לגבי האופן שבו רשתות ויסות גנים התפתחו עבור דמויות (תכונות) שנשמרו, עבור דמויות שהתפצלו, או עבור דמויות שהתפתחו באופן עצמאי.
עם זאת, בידוד רקמות או תאים מסוימים מנמטודות הוא אחד האתגרים הגדולים. עבור אורגניזמים רבים, תאים בודדים יכולים להיות מנותקים מרקמות ונקטפים בצורה לא משוחדת או שניתן לסמן אותם בביטוי ספציפי לרקמות של חלבון פלואורסצנטי ולמיין אותם על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS)11. ב-C. elegans, בידוד תאים בתפוקה גבוהה (HTP) הוגבל בעיקר לעוברים מכיוון שהציפורן החיצונית הקשוחה (והשלד ההידרוסטטי) פגעה בבידוד התאים מהזחלים ומהבוגרים. כדי לעקוף את האתגר הזה, שיטות מסוימות השתמשו בכלים גנטיים בתולעי C. elegans שלמות, כגון תיוג mRNA ספציפי לרקמות12, והשוואות ביטוי דיפרנציאליות בין סוג בר למוטנטים המשפיעים על סוג תא13. שיטות עדכניות יותר התגברו על האתגר על ידי המסת הציפורן כדי לבודדגרעינים 14 או תאים שלמים 8,9,15. לבידוד התא ולתרבית התאים יש את החסרונות הברורים, עם זאת, שהתאים מוסרים מההקשר ההתפתחותי או האנטומי הטבעי שלהם – למשל, הרחק מאיתות תאי-תא ומגע עם המטריצה החוץ-תאית – שצפויים להשפיע על פרופיל ביטוי הגנים15. יתר על כן, הכלים הגנטיים והסמנים הספציפיים לרקמות הם ספציפיים למין (כלומר, ניתן להשתמש בהם רק ב- C. elegans).
LMD מספק שיטה חלופית לבידוד רקמות מבלי לשבש את ההקשר הטבעי של התאים. באופן משמעותי עבור EDB, LMD מאפשר גם להשוות תעתיקים מרקמות הומולוגיות של מינים שונים ללא צורך בערכות כלים גנטיות ספציפיות למינים אם קיימים רצפי גנום או תעתיקים שלמים של מינים אלה. LMD כולל מיקוד רקמות על ידי תצפית מיקרוסקופית ישירה ושימוש במיקרובאם לייזר – המשולב באופטיקה של המיקרוסקופ – כדי לחתוך ולקצור (ללכוד) את הרקמה המעניינת16. המגבלות של LMD הן שהוא אינו תורם לגישות HTP מאוד (אם כי פרופילי השעתוק של קצות הזנב, כמתואר בפרוטוקול זה, היו חזקים עם ~ 70 דגימות), דגימות מסוימות עשויות להיות קשות לניתוח, וחיתוכים מוגבלים לדיוק הלייזר ולמה שניתן לדמיין במיקרוסקופ.
מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתאר כיצד ניתן להשתמש ב-LMD, ואחריו RNA-Seq חד-רקמתי, כדי לקבל נתוני שעתוק ספציפיים לשלב ולרקמות מנמטודות. באופן ספציפי, הוא מדגים LMD לבידוד קצוות זנב מזחלים בשלב הרביעי (L4) של C. elegans. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מותאמת לרקמות אחרות, וכמובן, מינים שונים.
ב – C. elegans, ישנם 4 תאים היוצרים את קצה הזנב הן אצל הזכרים והן אצל ההרמפרודיטים. במהלך שלב L4 אצל זכרים – אך לא אצל הרמפרודיטים – תאי קצה הזנב משנים את צורתם ונודדים פנימה. תהליך זה מתרחש גם בחלק ממיני הנמטודות האחרים, אך לא בכולם. לכן, קצה הזנב הוא מודל טוב לאבולוציה של מורפוגנזה דימורפית מינית. בגלל מיקומו, קל גם לבודד את קצה הזנב על ידי LMD.
כדי לקבל פרופילי שעתוק מקצות הזנב, הפרוטוקול הנוכחי משתמש ב-CEL-Seq2, שיטת RNA-seq שפותחה עבור תאים בודדים17,18. לשיטה זו יש מספר יתרונות עבור רקמות שמקורן ב- LMD. CEL-Seq2 הוא רגיש ויעיל ביותר, ומשתמש במזהים מולקולריים ייחודיים (UMIs) כדי לאפשר כימות פשוט של קריאות mRNA, שעתוק במבחנה כדי להבטיח הגברה ליניארית וברקוד המאפשר ריבוב של דגימות רקמה בודדות. המגבלה היחידה של CEL-Seq2 היא שקריאות משוחזרות מוטות לקצה 3′ של mRNA, ולכן לא ניתן להבחין ברוב האיזופורמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים של השיטה
אם תבוצע כראוי, השיטה המתוארת כאן תשיג פרופילי RNA חזקים עם מספר קטן יחסית של דגימות שנותחו בלייזר (70 קצות זנב בדוגמה זו). עם זאת, עבור דגימות מבעלי חיים מתפתחים, סנכרון הדוק הוא קריטי לצמצום השונות בין הדגימות. מסיבה זו, הפרוטוקול ממליץ על שיטת הבקיעה לסנכרון…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי NIH (R01GM141395) ומענקי NSF (1656736) למלגת DF ו- NIH (F32GM136170) ל- AW. איור 1 נוצר בעזרת BioRender.com.
Materials
| 0.5 µM PEN membrane glass slides RNase free | Leica | 11600288 | for LMD |
| 500 µL PCR tubes (nuclease-free) | Axygen | 732-0675 | to cut the tail tips into |
| Compound microscope with 40x objective and DIC | any | to check age of worms | |
| Desktop humidifier | any | ||
| Dissection microscope with transmitted light base | any | for all worm work | |
| glass pasteur pipets | any | handle of worm pick | |
| glass slides and coverslips | any | to check age of worms | |
| LMD6 microdissection system | Leica | multiple | to cut tail tips |
| LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf | 22431005 | |
| M9 Buffer | Recipe in WormBook | ||
| Methanol 99.8% | Sigma | 322415 | to fix worms |
| NGM growth medium | US Biological | N1000 | Buffers and salts need to be added: Recipe in WormBook |
| P10 pipette variablle volume | e.g. Gilson | ||
| P1000 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| P2 pipette variable volume | e.g. Gilson | ||
| Pipette tips 1,000 µL | any | ||
| Pipette tips 1-10 µL filtered | any | ||
| platinum iridium wire | Tritech | PT-9010 | to make worm pick |
| sterile and nuclease-free 1 mL centrfuge tubes | any | ||
| Tween 20 | Sigma | P9416 | Add a very small amount to M9 buffer to prevent worms from sticking to the pipet tips |
| vented 6 mm plastic Petri dishes | any | ||
| For CEL-Seq2 | |||
| 4200 TapeStation System with reagents for high-sensitivity RNA and DNA detection | Aligent | automated electrophoresis system | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA cleanup beads |
| Bead binding buffer 20% PEG8000, 2.5 M NaCl | |||
| CEL-Seq2 primers (see Table S1) | Sigma Genosys Mastercycler Nexus GX2 Eppendorf | 6335000020 | Thermal cycler with programmable lid and block for 200 µl tubes. |
| DNA Polymerase I (E. coli) | Invitrogen | 18052-025 | |
| dNTP mix 10 mM | any | ||
| E. coli DNA ligase | Invitrogen | 18052-019 | |
| Ethanol | |||
| ExoSAP-IT For PCR Product Clean-Up | Affymetrix | 78200 | exonuclease solution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | For step 4.6.1 |
| Nuclease-free water | any | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531 | PCR mix step 4.9.7 |
| random hexamer RT primer GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA NNNNNN |
IDT | a primer with 6 nucleotides that are random | |
| RNA Fragmentation buffer | NEB | E6150S | |
| RNA Fragmentation stop buffer | NEB | E6150S | |
| RNA PCR Index Primers (RPI1–RPI48) | Illumina, NEB, or IDT | RPIX in protocol step 4.9.7, sequences available from Illumina | |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Scientific | 7000TS1 | or any other similar product |
| RNaseH (E. coli) | Invitrogen | 18021-071 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | |
| Second strand buffer | Invitrogen | 10812-014 | |
| Superscripit II | Invitrogen | 18064-014 | reverse transcriptase |
References
- Haag, E. S., Fitch, D. H. A., Delattre, M. From "the worm" to "the worms" and back again: the evolutionary developmental biology of nematodes. Génétique. 210 (2), 397-433 (2018).
- Sommer, R. J., Bumbarger, D. J. Nematode model systems in evolution and development. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (3), 389-400 (2012).
- . WormBase Available from: https://wormbase.org/#012-3-6 (2022)
- . WormAtlas Available from: https://wormatlas.org (2022)
- . WormBook in Genetics Available from: https://academic.oup.com/genetics/pages/wormbook (2022)
- Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Kaletsky, R., Murphy, C. T. Transcriptional profiling of C. elegans adult cells and tissues with age. Methods in Molecular Biology. 2144, 177-186 (2020).
- Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971 (2019).
- Kulkarni, A., Anderson, A. G., Merullo, D. P., Konopka, G. Beyond bulk: a review of single cell transcriptomics methodologies and applications. Current Opinion in Biotechnology. 58, 129-136 (2019).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome Biology. 8 (7), 135 (2007).
- Baugh, L. R., et al. The homeodomain protein PAL-1 specifies a lineage-specific regulatory network in the C. elegans embryo. Development. 132 (8), 1843-1854 (2005).
- Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3′-end-seq. Nucleic Acids Research. 40 (13), 6304-6318 (2012).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505 (2011).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Yanai, I., Hashimshony, T. CEL-Seq2-single-cell RNA sequencing by multiplexed linear amplification. Methods in Molecular Biology. 1979, 45-56 (2019).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019 (2012).
- Baugh, L. R. To grow or not to grow: nutritional control of development during Caenorhabditis elegans L1 arrest. Génétique. 194 (3), 539-555 (2013).
- Baugh, L. R., Hu, P. J. Starvation responses throughout the Caenorhabditis elegans life cycle. Génétique. 216 (4), 837-878 (2020).
- Pepper, A. S., Killian, D. J., Hubbard, E. J. Genetic analysis of Caenorhabditis elegans glp-1 mutants suggests receptor interaction or competition. Génétique. 163 (1), 115-132 (2003).
- Mok, D. Z., Sternberg, P. W., Inoue, T. Morphologically defined sub-stages of C. elegans vulval development in the fourth larval stage. BMC Developmental Biology. 15, 26 (2015).
- Lytal, N., Ran, D., An, L. Normalization methods on single-cell RNA-seq data: an empirical survey. Frontiers in Genetics. 11, 41 (2020).
- Vieth, B., Ziegenhain, C., Parekh, S., Enard, W., Hellmann, I. powsimR: power analysis for bulk and single cell RNA-seq experiments. Bioinformatics. 33 (21), 3486-3488 (2017).
- Bolkova, J., Lanctot, C. Quantitative gene expression analysis in Caenorhabditis elegans using single molecule RNA FISH. Methods. 98, 42-49 (2016).
- Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
- Lee, C., et al. Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (12), 2357 (2017).
- Baird, S. E., Chamberlin, H. M. Caenorhabditis briggsae methods. WormBook. , 1-9 (2006).
- Felix, M. A. Oscheius tipulae. WormBook. , 1-8 (2006).
- Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Génétique. 216 (4), 947-956 (2020).
- Fernandes Povoa, E. E., Ebbing, A. L. P., Betist, M. C., vander Veen, C., Korswagen, H. C. An optimized dissociation protocol for FACS-based isolation of rare cell types from Caenorhabditis elegans L1 larvae. MethodsX. 7, 100922 (2020).
- Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).
- Steiner, F. A., Henikoff, S. Cell type-specific affinity purification of nuclei for chromatin profiling in whole animals. Methods in Molecular Biology. 1228, 3-14 (2015).
- Ebbing, A. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Developmental Cell. 47 (6), 801-813 (2018).
- Rödelsperger, C., et al. Spatial transcriptomics of nematodes identifies sperm cells as a source of genomic novelty and rapid evolution. Molecular Biology and Evolution. 38 (1), 229-243 (2021).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
