Kwantificeren van de bindingsinteracties tussen Cu (II) en peptideresiduen in de aan- en afwezigheid van chromoforen

Summary

Dit artikel richt zich op het gebruik van elektronische absorptiespectroscopie en isothermische titratiecalorimetrie om de thermodynamica van Cu (II) binding aan peptiden en eiwitten te onderzoeken en te kwantificeren.

Abstract

Koper (II) is een essentieel metaal in biologische systemen en verleent unieke chemische eigenschappen aan de biomoleculen waarmee het interageert. Er is gemeld dat het zich direct bindt aan een verscheidenheid aan peptiden en zowel noodzakelijke als pathologische rollen speelt, variërend van de bemiddelende structuur tot elektronenoverdrachtseigenschappen tot het geven van katalytische functie. Het kwantificeren van de bindingsaffiniteit en thermodynamica van deze Cu(II)-peptidecomplexen in vitro geeft inzicht in de thermodynamische drijvende kracht van binding, potentiële competities tussen verschillende metaalionen voor het peptide of tussen verschillende peptiden voor Cu(II), en de prevalentie van het Cu(II)-peptidecomplex in vivo. Het kwantificeren van de bindende thermodynamica kan echter een uitdaging zijn vanwege een groot aantal factoren, waaronder het verantwoorden van alle concurrerende evenwichten binnen een titratie-experiment, vooral in gevallen waarin er een gebrek is aan discrete spectroscopische handgrepen die het peptide, het d-blokmetaalion en hun interacties vertegenwoordigen.

Hier wordt een robuuste reeks experimenten geleverd voor de nauwkeurige kwantificering van Cu (II) -peptide thermodynamica. Dit artikel richt zich op het gebruik van elektronische absorptiespectroscopie in de aan- en afwezigheid van chromofoor liganden om de benodigde spectroscopische handgreep op Cu(II) te bieden en het gebruik van labelvrije isothermische titratiecalorimetrie. In beide experimentele technieken wordt een proces beschreven om rekening te houden met alle concurrerende evenwichten. Hoewel de focus van dit artikel ligt op Cu (II), kan de beschreven reeks experimenten van toepassing zijn buiten Cu (II) -peptide-interacties en een kader bieden voor nauwkeurige kwantificering van andere metaalpeptidesystemen onder fysiologisch relevante omstandigheden.

Introduction

De biologie is geëvolueerd om gebruik te maken van de diverse chemie van metaalionen die nodig zijn voor het leven om zich aan te passen en te overleven in de omgeving. Naar schatting 25%-50% van de eiwitten gebruikt metaalionen voor structuur en functie¹. De specifieke rol en redoxtoestand van het metaalion is direct gerelateerd aan de samenstelling en geometrie van de biologische liganden die het coördineren. Bovendien moeten redox-actieve metaalionen zoals Cu (II) strak worden gereguleerd, zodat ze niet interageren met oxidatiemiddelen via Fenton-achtige chemie om reactieve zuurstofsoorten (ROS) te vormen ^2,3,4. Het begrijpen van de bindingsmodi en affiniteit die de biochemie aansturen, zou moeten helpen de biologische rol van het metaalion op te helderen.

Veel technieken worden gebruikt om de bindingsinteracties van metalen en peptiden te bestuderen. Dit zijn meestal spectroscopische technieken, maar omvatten ook computersimulaties met behulp van moleculaire dynamica, zoals gezien door Cu(II) interacties met een fragment van amyloïde bèta (Aβ)⁵. Een veelgebruikte spectroscopische techniek die voor veel universiteiten toegankelijk is, is kernspinresonantie (NMR). Door gebruik te maken van de paramagnetische aard van Cu(II) konden Gaggelli et al. aantonen waar het metaalion zich bindt aan een petide door ontspanning van nabijgelegen kernen⁶. Elektron paramagnetische resonantie (EPR) kan ook worden gebruikt om de locatie en modus van de paramagnetische metaalionbinding^{te onderzoeken 7}. Andere spectroscopische technieken zoals circulair dichroïsme (CD) kunnen de coördinatie over Cu(II) in systemen zoals tripeptidesystemen⁸ beschrijven, en massaspectrometrie kan stoichiometrie aantonen en op welke residuen het metaalion wordt gecoördineerd door fragmentatiepatronen ^9,10.

Sommige van deze technieken, zoals NMR, zijn labelvrij, maar vereisen grote concentraties peptide, wat uitdagingen vormt voor studie. Een andere veel voorkomende techniek genaamd fluorescentiespectroscopie is gebruikt om de positie van een tyrosine of tryptofaan te relateren aan het blussen van een Cu (II) ^11,12. Evenzo kan deze techniek structurele veranderingen vertonen als gevolg van Cu(II)-binding¹³. Uitdagingen met deze metaal-peptidebindingsstudies zijn echter dat ze chromofoor aminozuren zoals tyrosine onderzoeken die niet alle systemen hebben, dat het metaalion bindt onder een klassiek model en dat de techniek mogelijk niet bevorderlijk is onder fysiologische omstandigheden. Er zijn inderdaad verschillende peptiden in opkomst die dergelijke chromofoor aminozuren niet bevatten of binden onder klassieke modellen, waardoor het gebruik van deze technieken wordt uitgesloten^14,15. Dit artikel beschrijft benaderingen voor het beoordelen van bindende eigenschappen in deze scenario’s onder fysiologisch relevante omstandigheden.

Biologische liganden kunnen verschillende protonatietoestanden aannemen die de metaalionbinding kunnen beïnvloeden, zoals de imidazoolring op histidine. Als de pH niet consistent wordt gehandhaafd, kunnen de resultaten ingewikkeld of tegenstrijdig zijn. Om deze reden zijn buffers een essentieel onderdeel in de studie van metaal-eiwit/peptide interacties. Van veel buffers is echter aangetoond dat ze gunstig interageren met metaalionen^16,17. Naast het concurreren met het biologische molecuul van belang, kan de buffer vergelijkbare coördinerende atomen hebben die moeilijk te onderscheiden zijn van de coördinerende atomen van het peptide of eiwit. In deze studie ligt de focus op elektronische absorptiespectroscopie en isothermische titratiecalorimetrie (ITC) als twee complementaire technieken voor het bestuderen van Cu(II)-peptide-interacties, met speciale overwegingen met betrekking tot bufferkeuze.

Elektronische absorptiespectroscopie is een snelle, breed toegankelijke techniek voor het bestuderen van metaalbindingsinteracties. Bestraling met licht in de ultraviolette (UV) of zichtbare golflengten kan leiden tot absorptie van metaalgecentreerde d-d-banden, die waardevolle informatie opleveren over ligandclassificatie, metaalgeometrieën en schijnbare bindingsaffiniteiten^18,19. Voor deze complexen kunnen directe titraties van metaalionen in eiwit- of peptideoplossingen bindende stoichiometrieën en schijnbare bindingsaffiniteiten kwantificeren. In sommige gevallen, zoals d⁵ of d¹⁰ elektronenconfiguraties, absorbeert het complex geen licht (d.w.z. is spectroscopisch stil). In deze spectroscopisch stille overgangsmetaalcomplexen kunnen deze beperkingen worden omzeild door een concurrerend ligand te gebruiken dat, bij coördinatie met het metaalion, detecteerbare ladingsoverdrachtsbanden oplevert. In beide gevallen is deze benadering beperkt tot het kwantificeren van alleen stoichiometrie en schijnbare bindingsaffiniteit, en wordt er geen inzicht in bindingsenthalpie gegeven zonder benaderingen.

Als aanvulling op informatie verkregen uit elektronische absorptiespectroscopie, is ITC een aantrekkelijke techniek voor directe en rigoureuze kwantificering van de bindende enthalpie²⁰. ITC meet direct de warmte die vrijkomt of wordt verbruikt tijdens een bindingsgebeurtenis en aangezien de titratie plaatsvindt bij constante druk, is de gemeten warmte de enthalpie van alle evenwichten (ΔH_ITC). Daarnaast worden de stoichiometrie van de bindingsgebeurtenis (n) en de schijnbare bindingsaffiniteit (K_ITC) gekwantificeerd. Uit deze parameters worden de vrije energie (ΔG_ITC) en entropie (ΔS_ITC) bepaald, waardoor een thermodynamische momentopname van de bindingsgebeurtenis ontstaat. Omdat het niet afhankelijk is van lichtabsorptie, is ITC een ideale techniek voor spectroscopisch stille soorten, bijvoorbeeld d⁵ of d¹⁰ metaalionencomplexen. Aangezien calorimetrie echter warmte meet, kunnen niet-overeenkomende buffersystemen en niet-geregistreerde evenwichten de analyse nadelig beïnvloeden om de metaalionenbindende thermodynamica nauwkeurig te bepalen, en er moet grote zorg worden besteed aan het aanpakken van deze factoren²⁰. Indien uitgevoerd met de juiste striktheid, is ITC een robuuste techniek voor het bepalen van de thermodynamica van metaal-eiwit / peptidecomplexen.

Hier wordt een chromoforisch stil koperbindend peptide, C-peptide, gebruikt om het complementaire gebruik van de twee technieken te demonstreren. C-peptide is een 31 residu splitsingsproduct (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) gevormd tijdens insulinerijping; het mist chromofore residuen, maar het is aangetoond dat het Cu(II) bindt met fysiologisch relevante affiniteit ^14,15. De Cu(II)-bindingsplaats bestaat uit de zijketens van een glutamaat en een aspartaat en de N-terminus van het peptide^14,15. Deze coördinerende atomen lijken sterk op die van veel gebruikte gebufferde systemen. Hier wordt het tandemgebruik van de d-d- en ladingsoverdrachtsbanden in elektronische absorptiespectroscopie en ITC getoond bij het kwantificeren van de Cu (II) bindende thermodynamica aan C-peptide. De benadering van het bestuderen van Cu (II) binding aan C-peptide kan worden toegepast op andere metaalionen en eiwit / peptide systemen.

Protocol

1. Elektronische absorptiespectroscopie: directe titratie met bufferconcurrentie Monstervoorbereiding Bereid een gebufferde oplossing van 50 mM 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propaan-1,3-diol (bisTris) bij pH 7,4 met ultrapuur water (>18 MΩ weerstand). Verwijder sporenmetaalionen door gedurende ten minste 2 uur te broeden met een hars met hoge affiniteit en daaropvolgende filtratie. Los een bekende hoeveelheid van het peptide op of verdun het in de metaalvrije…

Representative Results

Het doel was om de thermodynamica van Cu(II) binding aan C-peptide te kwantificeren en te bevestigen met behulp van de complementaire technieken van elektronische absorptiespectroscopie en ITC. Vanwege de robuuste aard van elektronische absorptiespectroscopie werd een directe titratie van Cu(II) in 300 μM C-peptide uitgevoerd (figuur 1). Toevoeging van 150 μM Cu(II) veroorzaakte een onmiddellijke toename van de band bij 600 nm, toegeschreven aan de d-d-band van Cu(II), en bleef toenemen to…

Discussion

Dit artikel biedt een robuuste methode voor het kwantificeren van de affiniteit en thermodynamica van Cu(II) binding aan peptiden. Complexen met Cu(II) zijn door de d⁹ elektronenconfiguratie bij uitstek geschikt om de d-d absorptieband op de metaallocatie te bewaken. Hoewel de extinctiecoëfficiënt klein is, waardoor grotere concentraties van het complex nodig zijn om een betrouwbaar signaal te leveren, kunnen titraties van Cu(II) in peptide snel inzicht geven in de bindingsstoomometrie en de geschatte bindin…

Materials

1,10-phenanthroline	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris buffer	Fisher	BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane	Nalgene	296-4545	Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer	Varian	Cary 5000	Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin	Sigma Aldrich	C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Low Volume
ITC analysis software	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software	TA Instruments	ITCRun
light-duty delicate wiper	Kimwipe	34155
loading syringe	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer	Alfa Aesar	A12914
spectrophotometer software	Cary	WinUV Scan
spreadsheet program	Microsoft	Excel	Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe	TA Instruments	5346
ultrapure water	Millipore Sigma	Milli-Q	Any water is okay as long as >18 MΩ resistance