إنشاء المواد العضوية من الأسنان البشرية كأداة قوية نحو البحث الميكانيكي والعلاج التجديدي
Summary
نقدم بروتوكولا لتطوير الثقافات العضوية الظهارية بدءا من الأسنان البشرية. المواد العضوية قابلة للتوسع بقوة وتلخص الخلايا الجذعية الظهارية للسن ، بما في ذلك قدرتها على تمايز الأرومة المينيلولوجية. يوفر النموذج العضوي الفريد أداة واعدة لدراسة بيولوجيا الأسنان البشرية (الخلايا الجذعية) مع وجهات نظر لنهج تجديد الأسنان.
Abstract
الأسنان ذات أهمية رئيسية في الحياة ليس فقط للمضغ الغذائي والكلام ولكن أيضا للرفاهية النفسية. المعرفة حول تطور الأسنان البشرية والبيولوجيا نادرة. على وجه الخصوص ، لا يعرف الكثير عن الخلايا الجذعية الظهارية للسن ووظيفتها. نجحنا في تطوير نموذج عضوي جديد يبدأ من أنسجة الأسنان البشرية (أي جريب الأسنان ، المعزول عن أسنان العقل المستخرجة). المواد العضوية قابلة للتوسع بقوة وعلى المدى الطويل وتلخص حجرة الخلايا الجذعية الظهارية للأسنان البشرية المقترحة من حيث التعبير عن العلامة وكذلك النشاط الوظيفي. على وجه الخصوص ، فإن المواد العضوية قادرة على الكشف عن عملية تمايز الأرومة النخلية كما تحدث في الجسم الحي أثناء تكوين الأميلوجينيا. سيوفر هذا النموذج العضوي الفريد أداة قوية لدراسة ليس فقط تطور الأسنان البشرية ولكن أيضا أمراض الأسنان ، وقد يمهد الطريق نحو العلاج التجديدي للأسنان. يمكن أن يكون استبدال الأسنان المفقودة بسن بيولوجي يعتمد على هذا النموذج العضوي الجديد بديلا جذابا للزرع القياسي الحالي للمواد الاصطناعية.
Introduction
الأسنان لها أدوار أساسية في المضغ الغذائي والكلام والرفاهية النفسية (الصورة الذاتية). يتكون السن البشري من أنسجة معدنية عالية الكثافة والصلابة متفاوتة1. مينا الأسنان ، المكون الرئيسي لتاج الأسنان ، هو أعلى الأنسجة المعدنية في جسم الإنسان. أثناء تكوين المينا (تكوين المينا) ، عندما تتطور الأسنان ، تتمايز الخلايا الجذعية الظهارية للأسنان (DESCs) إلى خلايا مكونة للمينا (الخلايا المينائية). بمجرد تشكيله ، نادرا ما يتم إصلاح المينا أو تجديدها بسبب فقدان الاستماتة للخلايا النخلية في بداية ثوران الأسنان1. يتم حاليا استعادة أنسجة المينا التالفة ، كما هو ناجم عن الصدمة أو الأمراض البكتيرية ، باستخدام مواد اصطناعية ؛ ومع ذلك ، فإن هؤلاء منزعجون من أوجه القصور المهمة مثل التسرب الدقيق ، والتكامل العظمي السفلي والمرساة ، والعمر الافتراضي المحدود ، وعدم وجود إصلاح يعمل بكامل طاقته2. وبالتالي ، فإن وجود ثقافة قوية وموثوقة من DESCs البشرية مع القدرة على توليد الخلايا النخلية والقدرة على إنتاج الأنسجة المعدنية سيكون خطوة كبيرة إلى الأمام في مجال تجديد الأسنان.
المعرفة حول النمط الظاهري البشري DESC والوظيفة البيولوجية نادرة3،4،5. ومن المثير للاهتمام ، تم اقتراح وجود DESCs من الأسنان البشرية في مساند الخلايا الظهارية في Malassez (ERM) ، وهي مجموعات الخلايا الموجودة داخل بصيلات الأسنان (DF) ، والتي تحيط بالأسنان غير المنفجرة ، وتظل موجودة في الرباط اللثوي حول الجذر بمجرد أن تندلع السن1. تم العثور على خلايا ERM المستزرعة بالاشتراك مع لب الأسنان للتمييز إلى خلايا تشبه الأرومة النخلية وتوليد أنسجة تشبه المينا6. ومع ذلك ، كانت الدراسات العميقة للدور المحدد لخلايا ERM في توليد المينا (إعادة) محدودة بسبب عدم وجود نماذج دراسة موثوقة7. يتم إعاقة أنظمة ERM الحالية في المختبر بسبب العمر الافتراضي المحدود والخسارة السريعة للنمط الظاهري في ظروف 2D المستخدمة بشكل قياسي 8,9,10,11,12. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى نظام قابل للسحب في المختبر لتوسيع ودراسة وتمييز DESCs البشرية بأمانة.
خلال العقد الماضي ، تم تطبيق تقنية قوية لزراعة الخلايا الجذعية الظهارية في المختبر بنجاح على عدة أنواع من الأنسجة الظهارية (البشرية) لدراسة بيولوجيتها وكذلك المرض13،14،15،16. تمكن هذه التقنية الخلايا الجذعية الظهارية للأنسجة من التطور الذاتي إلى إنشاءات خلايا 3D (أي عضويات) عند زرعها في مصفوفة خارج الخلية (ECM) – تحاكي السقالة (عادة ، Matrigel) وتزرع في وسط محدد يكرر إشارات الخلايا الجذعية المتخصصة في الأنسجة و / أو تكوين الجنين. تشمل عوامل النمو النموذجية اللازمة لتطوير العضوية عامل نمو البشرة (EGF) ومنشطات موقع تكامل MMTV بدون أجنحة (WNT)14،15،16. تتميز المواد العضوية الناتجة عن ذلك بالإخلاص الدائم في محاكاة الخلايا الجذعية الظهارية الأصلية للأنسجة ، بالإضافة إلى قابلية عالية للتوسع مع الحفاظ على نمطها الظاهري وخصائصها الوظيفية ، وبالتالي التغلب على توافر الأنسجة البشرية الأولية المحدودة في كثير من الأحيان كما تم الحصول عليها من العيادة. لإنشاء المواد العضوية ، لا يلزم عزل الخلايا الجذعية الظهارية عن الأنسجة غير المتجانسة (أي التي تضم أنواعا أخرى من الخلايا مثل الخلايا الوسيطة) قبل الزراعة لأن الخلايا الوسيطة لا تلتصق ب ECM أو تزدهر فيه ، مما يؤدي في النهاية إلى عضويات ظهارية بحتة13،16،17،18،19 . وقد أدت هذه التكنولوجيا الواعدة ومتعددة الاستخدامات إلى تطوير نماذج عضوية متعددة من مختلف الأنسجة الظهارية البشرية. ومع ذلك ، فإن المواد العضوية المشتقة من الأسنان البشرية ، ذات القيمة للدراسة العميقة لتطور الأسنان وتجديدها ومرضها ، لم يتم إنشاؤها بعد20,21. لقد نجحنا مؤخرا في تطوير مثل هذا النموذج العضوي الجديد بدءا من أنسجة DF من الأضراس الثالثة (ضرس العقل) المستخرجة من المرضى المراهقين19.
هنا ، نصف بروتوكول تطوير الثقافات العضوية الظهارية من الأسنان البشرية البالغة (أي من DF للأضراس الثالثة) (الشكل 1A). تعبر المواد العضوية الناتجة عن علامات الجذع المرتبطة ب ERM بينما تكون قابلة للتوسع على المدى الطويل. ومن المثير للاهتمام ، على عكس معظم النماذج العضوية الأخرى ، أن EGF المطلوب عادة زائد عن الحاجة لتطوير ونمو عضوي قوي. ومن المثير للاهتمام ، أن المواد العضوية الجذعية تظهر خصائص تمايز الأرومة النمائية ، وبالتالي تحاكي ميزات وعمليات ERM / DESC التي تحدث في الجسم الحي. يسمح النموذج العضوي الجديد والفريد من نوعه الموصوف هنا باستكشاف بيولوجيا DESC واللدونة والقدرة على التمايز ويفتح الباب لاتخاذ الخطوات الأولى نحو نهج تجديد الأسنان.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول الجيل الفعال والقابل للتكرار من المواد العضوية بدءا من الأسنان البشرية. على حد علمنا ، هذه هي المنهجية الأولى لإنشاء العضوية ذات المفهوم الحالي (الظهارية) بدءا من أنسجة الأسنان البشرية. المواد العضوية قابلة للتوسيع على المدى الطويل وتعرض النمط الظاهري الظاهري للجذع ال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لجميع موظفي جراحة الفم والوجه والفكين (MKA) في UZ Leuven ، وكذلك المرضى ، لمساعدتهم التي لا تقدر بثمن في جمع الأضراس الثالثة المستخرجة حديثا. نود أيضا أن نشكر الدكتورة رينهيلد جاكوبس والدكتورة إليزابيث تيجسكينز على مساعدتهما في جمع العينات. تم دعم هذا العمل من خلال منح من KU Leuven (BOF) و FWO-Flanders (G061819N). L.H. هو زميل دكتوراه FWO (1S84718N).
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 – 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
References
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L., Zavan, B., Bressan, E. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
- Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
- Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
- Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
- Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
- Kim, G. -. H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
- Nam, H., et al. Establishment of Hertwig’s epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
- Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
- Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
- Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
- Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig’s epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
- Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
- Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn’t orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
- Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
- . Future Health Biobank Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022)
- Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
- Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
- Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12 (2021).
