ביסוס אורגנואידים מהשן האנושית ככלי רב עוצמה לקראת מחקר מכניסטי וטיפול רגנרטיבי
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח תרביות אורגנואידים אפיתליאליות החל מהשן האנושית. האורגנואידים ניתנים להרחבה חזקה ומשקמים מחדש את תאי הגזע האפיתליאליים של השן, כולל יכולת התמיינות האמלובלסט שלהם. המודל האורגנואידי הייחודי מספק כלי מבטיח לחקר הביולוגיה הדנטלית האנושית (תאי גזע) עם פרספקטיבות לגישות התחדשות שיניים.
Abstract
שיניים הן בעלות חשיבות מרכזית בחיים לא רק עבור מסטיק מזון ודיבור אלא גם עבור רווחה פסיכולוגית. הידע על התפתחות השיניים והביולוגיה האנושית הוא נדיר. בפרט, לא הרבה ידוע על תאי הגזע האפיתליאליים של השן ותפקודם. הצלחנו לפתח מודל אורגנואידי חדשני המתחיל מרקמת השן האנושית (כלומר, זקיק שיניים, מבודד משיני בינה שנלקחו). האורגנואידים ניתנים להרחבה באופן חזק וארוך טווח ומשחזרים את תא תאי הגזע המוצעים של אפיתל השיניים האנושיות במונחים של ביטוי סמנים כמו גם פעילות תפקודית. בפרט, האורגנואידים מסוגלים לפרוש תהליך התמיינות אמלובלסט כפי שמתרחש in vivo במהלך אמלוגנזה. מודל אורגנואידי ייחודי זה יספק כלי רב עוצמה לחקר לא רק התפתחות השיניים האנושיות אלא גם פתולוגיה דנטלית, ועשוי לסלול את הדרך לטיפול בשיניים רגנרטיביות. החלפת שיניים אבודות בשן ביולוגית המבוססת על מודל אורגנואידי חדש זה עשויה להיות חלופה מושכת להשתלה הסטנדרטית הנוכחית של חומרים סינתטיים.
Introduction
לשיניים יש תפקידים חיוניים במזון, בדיבור וברווחה הפסיכולוגית (דימוי עצמי). השן האנושית מורכבת מרקמות שעברו מינרליזציה גבוהה בצפיפות ובקשיות שונות1. אמייל דנטלי, המרכיב העיקרי של כתר השן, הוא הרקמה המינרלית הגבוהה ביותר בגוף האדם. במהלך היווצרות אמייל (amelogenesis), כאשר השיניים מתפתחות, תאי גזע אפיתליאליים דנטליים (DESCs) מתמיינים לתאים יוצרי אמייל (ameloblasts). לאחר שנוצר, האמייל הוא רק לעתים רחוקות מתוקן או מתחדש עקב אובדן apoptotic של ameloblasts בתחילת התפרצות השן1. שחזור של רקמת אמייל פגומה, כפי שנגרם על ידי טראומה או מחלה חיידקית, נעשה כיום באמצעות חומרים סינתטיים; עם זאת, אלה מוטרדים מחסרונות חשובים כגון microleakage, osseointegration נחות ומעגן, אורך חיים סופי, והיעדר תיקון פונקציונלי מלא2. לפיכך, תרבית חזקה ואמינה של DESCs אנושיים עם היכולת ליצור אמלובסטים והפוטנציאל לייצר רקמה מינרלית תהיה צעד גדול קדימה בתחום ההתחדשות הדנטלית.
הידע על פנוטיפ DESC אנושי ותפקוד ביולוגי הם נדירים 3,4,5. באופן מעניין, DESCs של שיני אדם הוצעו להתקיים במשענות תאי האפיתל של מלאסז (ERM), אשכולות תאים הנמצאים בתוך זקיק השיניים (DF), המקיף שיניים לא משוננות, ונשארים נוכחים ברצועת החניכיים סביב השורש ברגע שהשן מתפרצת1. נמצא כי תאי ERM בתרבית משותפת עם עיסת שיניים מתמיינים לתאים דמויי אמלובסט ומייצרים רקמה דמוית אמייל6. עם זאת, מחקרים מעמיקים על התפקיד הספציפי של תאי ERM ביצירת אמייל (re-) היו מוגבלים בשל היעדר מודלים מחקריים אמינים7. מערכות התרביות החוץ-גופיות הנוכחיות של ERM נפגעות על ידי אורך חיים מוגבל ואובדן מהיר של פנוטיפ בתנאים הדו-ממדיים הנמצאים בשימוש סטנדרטישל 8,9,10,11,12. לפיכך, יש צורך רב במערכת חוץ גופית הניתנת להרחבה, למידה והבחנה נאמנה של DESCs אנושיים.
במהלך העשור האחרון, טכניקה רבת עוצמה לגידול תאי גזע אפיתליאליים במבחנה יושמה בהצלחה בכמה סוגים של רקמות אפיתל (אנושיות) כדי לחקור את הביולוגיה שלהן, כמו גם מחלה 13,14,15,16. טכנולוגיה זו מאפשרת לתאי הגזע של אפיתל הרקמה להתפתח בעצמם למבנים תלת-ממדיים של תאים (כלומר, אורגנואידים) כאשר הם נזרעים לתוך מטריצה חוץ-תאית (ECM) המחקה פיגום (בדרך כלל, Matrigel) ותרבית במדיום מוגדר המשחזר את האיתות ו/או את ה-embryogenesis של נישת תאי הגזע של הרקמה ו/או את ה-embryogenesis. גורמי גדילה אופייניים הדרושים להתפתחות אורגנואידים כוללים גורם גדילה אפידרמלי (EGF) ומפעילי אתר אינטגרציה מסוג MMTV ללא כנפיים (WNT) 14,15,16. האורגנואידים המתקבלים מאופיינים בנאמנות מתמשכת בחיקוי תאי הגזע האפיתליאליים המקוריים של הרקמה, כמו גם ביכולת הרחבה גבוהה תוך שמירה על הפנוטיפ והתכונות התפקודיות שלהם, ובכך להתגבר על זמינות הרקמות האנושיות הראשוניות המוגבלות לעתים קרובות כפי שנרכשו מהמרפאה. כדי לבסס אורגנואידים, אין צורך בבידוד תאי הגזע האפיתליאליים מהרקמה ההטרוגנית (כלומר, המורכבת מסוגי תאים אחרים כגון תאים מזנכימליים) לפני התרבות, שכן תאים מזנכימליים אינם מתחברים ל-ECM או משגשגים בו, וכתוצאה מכך בסופו של דבר האורגנואידים האפיתליאלייםגרידא 13,16,17,18,19 . טכנולוגיה מבטיחה ורב-תכליתית זו הובילה לפיתוח מודלים אורגנואידיים מניפולטיביים מרקמות אפיתל אנושיות שונות. עם זאת, אורגנואידים שמקורם בשיניים אנושיות, בעלי ערך למחקר מעמיק של התפתחות שיניים, התחדשות ומחלות, עדיין לא הוקמו20,21. לאחרונה הצלחנו לפתח מודל אורגנואידי חדש כזה המתחיל מרקמת DF מטוחנות שלישיות (שיני בינה) המופקות מחולים מתבגרים19.
כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לפיתוח תרביות אורגנואידיות אפיתליאליות מהשן האנושית הבוגרת (כלומר, מה-DF של הטוחנות השלישיות) (איור 1A). האורגנואידים המתקבלים מבטאים סמני גבעול הקשורים ל-ERM תוך שהם ניתנים להרחבה לטווח ארוך. באופן מסקרן, בניגוד לרוב המודלים האורגנואידיים האחרים, ה-EGF הנחוץ בדרך כלל מיותר להתפתחות וצמיחה אורגנואידית חזקה. באופן מעניין, האורגנואידים של הגבעול מראים תכונות התמיינות של אמלובלסט, ובכך מחקים תכונות ותהליכים של ERM/DESC המתרחשים ב-vivo. המודל האורגנואידי החדש והייחודי המתואר כאן מאפשר לחקור ביולוגיה של DESC, פלסטיות ויכולת הבחנה ופותח את הדלת לנקיטת הצעדים הראשונים לקראת גישות להתחדשות שיניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את הדור היעיל והניתן לשחזור של אורגנואידים החל מהשן האנושית. למיטב ידיעתנו, זוהי המתודולוגיה הראשונה לביסוס אורגנואידים בעלי מושג נוכחי (אפיתל) החל מרקמת השיניים האנושית. האורגנואידים ניתנים להרחבה לטווח ארוך ומציגים פנוטיפ של גבעול אפיתל השן, תוך שכפול DESCs שדווחו בעבר ב?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל אנשי הצוות של כירורגיית הפה והסתות (MKA) של UZ Leuven, כמו גם למטופלים, על עזרתם שלא תסולא בפז באיסוף טוחנות שלישיות שזה עתה הוצאו. ברצוננו להודות גם לד”ר ריינהילדה ג’ייקובס ולד”ר אליזבת טייסקנס על עזרתם באיסוף הדגימות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ- KU Leuven (BOF) ו- FWO-Flanders (G061819N). ל.ה. הוא עמית דוקטורט ב-FWO (1S84718N).
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 – 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
References
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
- Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L., Zavan, B., Bressan, E. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).
- Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
- Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
- Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
- Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
- Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
- Kim, G. -. H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
- Nam, H., et al. Establishment of Hertwig’s epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
- Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
- Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
- Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
- Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig’s epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
- Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
- Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn’t orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
- Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
- . Future Health Biobank Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022)
- Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
- Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
- Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
- Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12 (2021).
