यांत्रिक अनुसंधान और पुनर्योजी थेरेपी की ओर एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में मानव दांत से ऑर्गेनोइड की स्थापना
Summary
हम मानव दांत से शुरू होने वाले उपकला ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ऑर्गेनोइड मजबूती से विस्तार योग्य होते हैं और दांत की उपकला स्टेम कोशिकाओं को दोहराते हैं, जिसमें उनकी अमेलोब्लास्ट भेदभाव क्षमता भी शामिल है। अद्वितीय ऑर्गेनॉइड मॉडल दांत-पुनर्योजी दृष्टिकोण के दृष्टिकोण के साथ मानव दंत चिकित्सा (स्टेम सेल) जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक उपकरण प्रदान करता है।
Abstract
दांत न केवल भोजन और भाषण के लिए बल्कि मनोवैज्ञानिक कल्याण के लिए भी जीवन में महत्वपूर्ण महत्व रखते हैं। मानव दांत विकास और जीव विज्ञान पर ज्ञान दुर्लभ है। विशेष रूप से, दांत की उपकला स्टेम कोशिकाओं और उनके कार्य के बारे में बहुत कुछ ज्ञात नहीं है। हम मानव दांत ऊतक (यानी, दंत कूप, निकाले गए ज्ञान दांतों से पृथक) से शुरू होने वाले एक उपन्यास ऑर्गेनोइड मॉडल को विकसित करने में सफल रहे। ऑर्गेनोइड मजबूत और दीर्घकालिक विस्तार योग्य हैं और मार्कर अभिव्यक्ति के साथ-साथ कार्यात्मक गतिविधि के संदर्भ में प्रस्तावित मानव दांत उपकला स्टेम सेल डिब्बे को दोहराते हैं। विशेष रूप से, ऑर्गेनोइड एक एमेलोब्लास्ट भेदभाव प्रक्रिया को प्रकट करने में सक्षम हैं जैसा कि एमेलोजेनेसिस के दौरान विवो में होता है। यह अनूठा ऑर्गेनॉइड मॉडल न केवल मानव दांत विकास बल्कि दंत विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करेगा, और दांत-पुनर्योजी चिकित्सा की ओर मार्ग प्रशस्त कर सकता है। इस नए ऑर्गेनोइड मॉडल के आधार पर जैविक दांत के साथ खोए हुए दांतों को बदलना सिंथेटिक सामग्री के वर्तमान मानक आरोपण का एक आकर्षक विकल्प हो सकता है।
Introduction
खाद्य मैस्टिकेशन, भाषण और मनोवैज्ञानिक कल्याण (आत्म-छवि) में दांतों की आवश्यक भूमिका होती है। मानव दांत में अलग-अलग घनत्व और कठोरता के अत्यधिक खनिज युक्त ऊतक होते हैं1. दंत तामचीनी, दांत मुकुट का मुख्य घटक, मानव शरीर में उच्चतम खनिज युक्त ऊतक है। तामचीनी गठन (एमेलोजेनेसिस) के दौरान, जब दांत विकसित होते हैं, तो दंत उपकला स्टेम कोशिकाएं (डीईएससी) तामचीनी बनाने वाली कोशिकाओं (एमेलोब्लास्ट्स) में अंतर करती हैं। एक बार बनने के बाद, दांत विस्फोट की शुरुआत में एमेलोब्लास्ट्स के एपोप्टोटिक नुकसान के कारण तामचीनी की शायद ही कभी मरम्मत या नवीनीकृत किया जाता है1. क्षतिग्रस्त तामचीनी ऊतक की बहाली, जैसा कि आघात या जीवाणु रोग के कारण होता है, वर्तमान में सिंथेटिक सामग्री का उपयोग करके पूरा किया जाता है; हालाँकि, ये महत्वपूर्ण कमियों जैसे माइक्रोलीकेज, अवर ओसियोइंटीग्रेशन और एंकरेज, परिमित जीवन काल और पूरी तरह कार्यात्मक मरम्मत की कमी से परेशान हैं2. इसलिए, एमेलोब्लास्ट उत्पन्न करने की क्षमता और खनिज युक्त ऊतक का उत्पादन करने की क्षमता के साथ मानव डीईएससी की एक मजबूत और विश्वसनीय संस्कृति दंत पुनर्योजी क्षेत्र में एक बड़ा कदम होगा।
मानव डीईएससी फेनोटाइप और जैविक कार्य पर ज्ञान दुर्लभ 3,4,5 है। दिलचस्प बात यह है कि मानव दांतों के डीईएससी को एपिथेलियल सेल रेस्ट्स ऑफ मलासेज़ (ईआरएम) में मौजूद होने का प्रस्ताव दिया गया है, दंत कूप (डीएफ) के भीतर मौजूद सेल क्लस्टर, जो अनियंत्रित दांतों को घेरता है, और दांत फटने के बाद जड़ के चारों ओर पीरियडोंटल लिगामेंट में मौजूद रहता है1. दंत लुगदी के साथ सह-संवर्धित ईआरएम कोशिकाओं को अमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं में अंतर करने और तामचीनी जैसे ऊतक उत्पन्न करने के लिए पाया गयाहै 6. हालांकि, तामचीनी (पुन: ) पीढ़ी में ईआरएम कोशिकाओं की विशिष्ट भूमिका का गहन अध्ययन विश्वसनीय अध्ययन मॉडल7 की कमी के कारण सीमित किया गया है। वर्तमान ईआरएम इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों को सीमित जीवन काल और 2 डी स्थितियों में फेनोटाइप के त्वरित नुकसान से बाधित किया जाता है जो मानक रूप से उपयोग की जाने वाली 8,9,10,11,12 हैं। इसलिए, मानव डीईएससी का ईमानदारी से विस्तार, अध्ययन और अंतर करने के लिए एक ट्रैक्टेबल इन विट्रो सिस्टम की दृढ़ता से आवश्यकता है।
पिछले दशक के दौरान, इन विट्रो में उपकला स्टेम कोशिकाओं को विकसित करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक को उनके जीव विज्ञान के साथ-साथ रोग13,14,15,16 का अध्ययन करने के लिए कई प्रकार के (मानव) उपकला ऊतकों पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है। यह तकनीक ऊतक उपकला स्टेम कोशिकाओं को 3 डी सेल निर्माण (यानी, ऑर्गेनोइड्स) में आत्म-विकसित करने में सक्षम बनाती है जब एक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) -नकल मचान (आमतौर पर, मैट्रिगेल) में वरीयता प्राप्त होती है और ऊतक के स्टेम सेल आला सिग्नलिंग और / ऑर्गेनॉइड विकास के लिए आवश्यक विशिष्ट विकास कारकों में एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) और विंगलेस-टाइप एमएमटीवी इंटीग्रेशन साइट (डब्ल्यूएनटी) एक्टिवेटर14,15,16 शामिल हैं। परिणामी ऑर्गेनोइड को ऊतक की मूल उपकला स्टेम कोशिकाओं की नकल करने में स्थायी निष्ठा की विशेषता है, साथ ही साथ उनके फेनोटाइप और कार्यात्मक गुणों को बनाए रखते हुए उच्च विस्तारशीलता, जिससे क्लिनिक से प्राप्त अक्सर सीमित प्राथमिक मानव ऊतक उपलब्धता पर काबू पा लिया जाता है। ऑर्गेनोइड स्थापित करने के लिए, संवर्धन से पहले विषम ऊतक (यानी, अन्य सेल प्रकार जैसे मेसेनकाइमल कोशिकाओं को शामिल करते हुए) से उपकला स्टेम कोशिकाओं के अलगाव की आवश्यकता नहीं होती है क्योंकि मेसेनकाइमल कोशिकाएं ईसीएम से जुड़ी या पनपती नहीं हैं, जिसके परिणामस्वरूप अंततः विशुद्ध रूप से उपकला ऑर्गेनोइड 13,16,17,18,19 . इस आशाजनक और बहुमुखी तकनीक ने विभिन्न मानव उपकला ऊतकों से कई गुना ऑर्गेनोइड मॉडल के विकास का नेतृत्व किया है। हालांकि, मानव दांत-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड, दांतों के विकास, उत्थान और बीमारी के गहन अध्ययन के लिए मूल्यवान, अभी तक20,21 स्थापित नहीं किए गए थे। हम हाल ही में किशोर रोगियों से निकाले गए तीसरे दाढ़ (ज्ञान दांत) से डीएफ ऊतक से शुरू होने वाले इस तरह के एक नए ऑर्गेनोइड मॉडल को विकसित करने में सफलरहे।
यहां, हम वयस्क मानव दांत (यानी, तीसरे दाढ़ के डीएफ से) (चित्रा 1 ए) से उपकला ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को विकसित करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। परिणामी ऑर्गेनोइड दीर्घकालिक विस्तार योग्य होने के दौरान ईआरएम से जुड़े स्टेमनेस मार्करों को व्यक्त करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि अधिकांश अन्य ऑर्गेनोइड मॉडल के विपरीत, आमतौर पर आवश्यक ईजीएफ मजबूत ऑर्गेनोइड विकास और विकास के लिए अनावश्यक है। दिलचस्प बात यह है कि स्टेमनेस ऑर्गेनोइड अमेलोब्लास्ट भेदभाव गुण दिखाते हैं, जिससे विवो में होने वाली ईआरएम / डीईएससी सुविधाओं और प्रक्रियाओं की नकल होती है। यहां वर्णित नया और अनूठा ऑर्गेनॉइड मॉडल डीईएससी जीव विज्ञान, प्लास्टिसिटी और भेदभाव क्षमता की खोज करने की अनुमति देता है और दांत-पुनर्योजी दृष्टिकोण की ओर पहला कदम उठाने के लिए दरवाजा खोलता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल मानव दांत से शुरू होने वाले ऑर्गेनोइड की कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी का वर्णन करता है। हमारे ज्ञान के लिए, यह मानव दंत ऊतक से शुरू होने वाले वर्तमान-अवधारणा (उपकला) ऑर्गेनो?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम यूजेड ल्यूवेन के ओरल और मैक्सिलोफेशियल सर्जरी (एमकेए) के सभी कर्मचारियों के सदस्यों के साथ-साथ रोगियों के लिए आभारी हैं, ताजा निकाले गए तीसरे दाढ़ को इकट्ठा करने में उनकी अमूल्य मदद के लिए। हम नमूना संग्रह में उनकी मदद के लिए डॉ रेनहिल्ड जैकब्स और डॉ एलिजाबेथ तिजस्केंस को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को केयू ल्यूवेन (बीओएफ) और एफडब्ल्यूओ-फ्लैंडर्स (जी 061819 एन) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एलएच एक एफडब्ल्यूओ पीएचडी फेलो (1 एस 84718 एन) है।
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
| 48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
| AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
| B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Cassette | VWR | 7202191 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
| CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
| Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
| CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Cover glass | VWR | 6310146 | |
| Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
| DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
| DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 – 10ML | |
| Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
| GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
| Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
| Glycine | VWR | 101194M | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
| InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
| Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
| Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
| Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish | Corning | 353002 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
| Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
| Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
| SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
| Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
| SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
| Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
| SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
| StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
| Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
| Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
| Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
| Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Transferrin | Serva | 36760.01 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
| Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
| WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
| Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
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