C57BL / 6小鼠中Theiler小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)的脑内感染复制了人类患者病毒性脑炎和随后癫痫的许多早期和慢性临床症状。本文描述了TMEV模型的病毒感染、症状和组织病理学。
癫痫的主要原因之一是中枢神经系统(CNS)感染;因此,在这种感染中幸存下来的患者中约有8%会发展为癫痫,在经济欠发达国家,这一比例要高得多。这项工作概述了感染性病因的癫痫建模,并将其用作新型抗癫痫化合物检测的平台。提出了在C57BL / 6小鼠中通过非立体定向脑内注射Theiler小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)诱导癫痫的方案,该方案复制了病毒性脑炎和随后癫痫的许多早期和慢性临床症状在人类患者中。描述了脑炎期间小鼠的临床评估,以监测癫痫发作活动并检测新型化合物的潜在抗癫痫作用。此外,还显示了病毒性脑炎和癫痫发作(如海马损伤和神经炎症)的组织病理学后果,以及自发性癫痫发作等长期后果。TMEV模型是首批转化的,感染驱动的实验平台之一,允许研究中枢神经系统感染引起的癫痫发展机制。因此,它还有助于为中枢神经系统感染后有患癫痫风险的患者确定潜在的治疗靶点和化合物。
病毒性脑炎的常见后果之一是癫痫发作。许多病毒感染在感染的急性期引发症状性癫痫发作;在公众中,此类癫痫发作的风险增加了20%以上1,2,3。感染后存活的患者在感染后的数月至数年内发生慢性癫痫的风险也增加 4%-20%1,4。泰勒鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)已被确定为研究病毒性脑炎小鼠模型中急性和慢性癫痫发作的合适病毒5,6,7。TMEV是小核糖核酸病毒科的一种无包膜,阳性,单链RNA病毒,传统上用于研究SJL小鼠脊髓中的脱髓鞘,C57BL / 6(B6)小鼠受到保护,因为它们具有感染后快速清除病毒的能力。然而,TMEV在感染后第一周(pi)内诱导50%-75%的雄性和雌性B6小鼠急性癫痫发作,而约25%-40%的小鼠在数周至数月pi2,5,6,8,9中发生慢性癫痫。除了癫痫发作外,小鼠还表现出癫痫海马体的常见组织病理学,伴有神经变性和神经胶质增生5,6,8,10,11,12。此外,TMEV感染的B6小鼠在学习和记忆行为测试中表现明显较差,并且具有认知合并症,这也见于癫痫13,14,15的临床患者。
传统上,癫痫和癫痫发作模型利用化学惊厥物质或电刺激来诱导癫痫发作;然而,这些模型缺乏构建有效性,并且通常显示比临床患者更严重的癫痫发作和脑损伤16。没有适合每个研究问题的模型17.如果研究中枢神经系统感染后癫痫发作发展的诱发因素,或者如果筛选化合物的抗惊厥效率,则使用TMEV模型特别有趣。
由于TMEV模型已经在国际上几个不同的实验室中建立和使用,作者已经确定了允许成功实施该模型的许多细节,例如,不同病毒和小鼠株的特异性。最可靠的癫痫发作诱导是用丹尼尔的TMEV和B6J小鼠2,5,6,8,9株产生的。该模型目前被国家神经疾病和中风研究所(NINDS)用作识别针对癫痫和癫痫发作的新药的平台18,19。本文包括病毒诱导和临床监测的详细方案,以允许其他研究人员利用这种病毒性脑炎模型来进一步了解疾病机制以及药物测试。
以下协议反映了为该模型中的化合物测试而设计的研究,尽管可以进行许多其他类型的研究。在右半球颞区(右眼后部和内侧)注射丹尼尔TMEV菌株之前,对小鼠进行短暂麻醉。根据研究问题,如果需要未感染的对照动物,小鼠接受无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4,包括KH 2 PO4 [1.06 mM],NaCl [155.17 mM]和Na 2 HPO4·7H 2 O[2.97mM])而不是TMEV。先前在TMEV感染小鼠中的经验表明,处理诱导的癫痫发作发生在感染后第3天和第7天之间。实验化合物的进样频率、途径和测试时间根据其性质而变化。建议在周五进行病毒接种,这样可以在下周(周一至周五)进行第3-7天的癫痫发作监测。在癫痫监测周期间,实验化合物可以每天两次(至少间隔4小时)给药(ip),除非化合物的动力学或作用机制另有建议。治疗期间的癫痫发作监测可以在先前确定的时间点进行。进样和观察时间因个别化合物而异。向动物注射测试化合物或代替药物化合物的载体。这两组可以像实验组类似地处理和观察。在实验过程中,处理小鼠并对癫痫发作进行评分的一个人应该对治疗不知情。
这是第一个基于感染的癫痫啮齿动物模型,可以调查急性和慢性癫痫发作的发展。它将有助于确定药物靶点和新化合物,用于预防或改变癫痫最常见病因之一的疾病。
如上所述,可能需要仔细考虑批次和病毒滴度,以确保足够比例的TMEV处理小鼠表现出处理诱导的癫痫发作。如果动物的癫痫发作次数比平时少,请使用一批N = 20只动物来验证病毒效率。如果其活性降低(小于50%),则是时候制作新的等分试样并用N = 20只动物进行测试。如果新的等分试样没有更有效,则应纯化一批新的病毒。对于某些转基因小鼠系,可能需要使用较低的病毒滴度;因此,初步实验后应根据需要稀释病毒滴度。B6小鼠的大多数可用数据来自杰克逊实验室(美国缅因州巴尔港或德国苏尔茨菲尔德查尔斯河);然而,从Harlan(德国埃斯特鲁普)获得的B6小鼠的癫痫发作率相似,已得到证实8。具有B6背景的转基因动物的癫痫发作率与野生型B6小鼠相当,但如果遗传变化对病毒入侵,炎症反应或神经变性有影响,则可能会有所不同21。急性癫痫发作是自发观察到的,但由处理和噪音触发,因此在比较癫痫发作率时,以类似的方式处理所有动物至关重要。以前,每天两次的处理提供了高癫痫发作负担,并且在感染后第3-7天表现出癫痫发作的小鼠比例更高6,8,19。也可以使用额外的处理时间(第 1 天和第 2 天)来增加癫痫发作负担。此外,可以在每次处理之前观察动物,以确保不会发生自发性癫痫发作。例如,嘈杂的实验室环境可能会产生癫痫发作,这反过来又可能使动物在测试期间对处理引起的癫痫发作无效。
虽然TMEV感染在大多数小鼠中产生处理引起的癫痫发作,但尚不清楚为什么一些动物对这种治疗有抵抗力。如上所述,可能是电图癫痫发作(伴有轻微或没有相关行为)发生,并且通常无法在没有伴随脑电图记录的情况下进行量化。也可能是注射位置的微小差异有助于降低大脑中的病毒效应;然而,据报道,由于病毒对海马体的嗜性,皮质和纹状体感染5,6,8,9 后癫痫发作。对于该模型中的药物筛选研究,为了确定癫痫发作的减少(例如,癫痫发作负担减少50%),每组需要更多的动物(例如,N = 20)。此外,该模型中癫痫发作行为的可变性需要药物与载体效应的更大差异来确定癫痫发作的显着减少。因此,此模型的一个限制是对较大组规模的要求。然而,足够的组大小也允许识别该模型中的抗癫痫和抗炎作用19。
该模型中绝大多数可观察到的癫痫发作发生在急性感染期间。尽管在用TMEV治疗的小鼠中观察到海马变性,免疫细胞活化和认知缺陷,但只有一小部分接受治疗的动物最终会出现慢性自发性癫痫发作。这种低的总体癫痫发作负担将需要大量受感染的小鼠才能正确研究该模型中的自发癫痫发作,这超出了许多项目的范围和能力。深度电极植入和脑电图监测也会增加实验动物的负担。虽然深度电极可能有助于识别自发性癫痫发作活动,但感染后海马解剖结构的变化可能使电极放置的一致性成为一项挑战。
确定癫痫新疗法的迫切需要开发可用作抗癫痫疗效快速筛查方法的模型。此模型提供了解决此紧急请求的功能。此外,它不需要任何立体战术手术的事实使其成为研究抗癫痫化合物的合适且易于执行的模型。
The authors have nothing to disclose.
SB得到了柏林FU的启动资助。KSW由R37 NS065434和ALSAM基金会支持。LAB由D-SPAN奖项1F99NS125773-01支持。我们感谢Robert Fujinami博士为我们提供泰勒病毒和犹他大学细胞成像核心设施的显微镜支持。
Absorbent paper | – | – | any |
Analytical balance | Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) | 30216542 | 0. 1 mg–220 g |
Animal balance | Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) | STX2202 | 0.01 g–2200 g |
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD (Mississauga, ON, Canada) | BD329461 | Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle – 1 mL |
Daniel's strain of TMEV | kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) | – | 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s) |
Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super | Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany | – | Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol |
Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 22-363-750 | |
Fluriso | VETone (Boise, ID, U.S.A) | 502017 | Isoflurane 250 mL, 2%–5% |
Fume absorber | Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) | – | – |
General Protection Disposable SMS White Lab Coats | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 17-100-810A | |
GraphPad Prism version 9 | (La Jolla, CA, U.S.A.) | ||
Ice bucket | – | – | any |
Microsoft Excel Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
Microsoft Word Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
Mouse cage | – | – | any mouse cage holding at least 5 mice |
PrecisionGlide needles | BD (Mississauga, ON, Canada) | 329652 | BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes – 26 G x 3/8 – 0.45 mm x 10 mm |
Self-Sealing Sterilizing Pouch | Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) | NC9241087 | 12.6 x 25.5 cm |
Small glass flask | – | – | any, volume 25 mL |
sterile PBS | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 10010056 | |
Stir bar | Carl Roth GmbH & CO. KG | X171.1 | size according to volume of solution |
Stir plate | Carl Roth GmbH & CO. KG | AAN2.1 | |
Syringe Luer-Lok | BD (Mississauga, ON, Canada) | 309628 | 1 mL syringe only |
Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer | Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) | EW-08895-23 | Bath sonicator – 0.5 gal, 115 V |
Vehicle solution | – | – | depending on compound vehicle |
Vortex REAX | Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany | 541-10000-00 |