Intracerebral infektion med Theilers murine encephalomyelitis virus (TMEV) i C57BL/6 mus replikerer mange af de tidlige og kroniske kliniske symptomer på viral encephalitis og efterfølgende epilepsi hos humane patienter. Dette papir beskriver virusinfektion, symptomer og histopatologi af TMEV-modellen.
En af hovedårsagerne til epilepsi er en infektion i centralnervesystemet (CNS); Ca. 8% af patienterne, der overlever en sådan infektion, udvikler epilepsi som følge heraf, idet satserne er signifikant højere i mindre økonomisk udviklede lande. Dette arbejde giver et overblik over modellering af epilepsi af infektiøs ætiologi og brug af det som en platform for ny antibeslaglæggelsesforbindelse. En protokol for epilepsiinduktion ved ikke-stereotaktisk intracerebral injektion af Theilers murine encephalomyelitis virus (TMEV) i C57BL/6-mus præsenteres, som replikerer mange af de tidlige og kroniske kliniske symptomer på viral encefalitis og efterfølgende epilepsi hos humane patienter. Den kliniske evaluering af mus under encephalitis for at overvåge anfaldsaktivitet og detektere de potentielle antibeslaglæggelsesvirkninger af nye forbindelser beskrives. Desuden vises histopatologiske konsekvenser af viral encephalitis og anfald såsom hippocampal skade og neuroinflammation såvel som langsigtede konsekvenser såsom spontane epileptiske anfald. TMEV-modellen er en af de første translationelle, infektionsdrevne, eksperimentelle platforme, der gør det muligt at undersøge mekanismerne for epilepsiudvikling som følge af CNS-infektion. Det tjener således også til at identificere potentielle terapeutiske mål og forbindelser til patienter med risiko for at udvikle epilepsi efter en CNS-infektion.
En af de hyppige konsekvenser af viral encephalitis er epileptiske anfald. Mange virusinfektioner udløser symptomatiske anfald i den akutte fase af infektionen; Risikoen for sådanne beslaglæggelser øges med over 20% blandt befolkningen 1,2,3. Patienter, der overlever infektionen, har også en øget risiko på 4%-20% for at udvikle kronisk epilepsi i månederne til årene efter infektion 1,4. Theilers murin encephalomyelitis virus (TMEV) er blevet identificeret som en egnet virus til at studere akutte og kroniske anfald i en musemodel af viral encephalitis 5,6,7. TMEV er en ikke-indhyllet, positiv-sense, enkeltstrenget RNA-virus af Picornaviridae-familien og er traditionelt blevet brugt til at studere demyelinering i rygmarven hos SJL-mus, som C57BL/6 (B6) mus er beskyttet mod, fordi de har evnen til at rydde virussen hurtigt efter infektion. TMEV inducerer imidlertid akutte anfald hos 50%-75% af mandlige og kvindelige B6-mus inden for den første uge efter infektion (pi), mens ca. 25%-40% udvikler kronisk epilepsi uger til måneder pi 2,5,6,8,9. Bortset fra anfald viser musene også den fælles histopatologi af en epileptisk hippocampus med neurodegeneration og gliose 5,6,8,10,11,12. Desuden klarer TMEV-inficerede B6-mus sig signifikant dårligere i adfærdstest for læring og hukommelse og har kognitiv komorbiditet, hvilket også ses hos kliniske patienter med epilepsi13,14,15.
Traditionelt bruger modeller af epilepsi og anfald enten anvendelse af kemokonvulsive stoffer eller elektrisk stimulering til at fremkalde anfald; Disse modeller mangler imidlertid konstruktionsvaliditet og viser ofte mere alvorlige anfald og hjerneskade, end det ses hos kliniske patienter16. Der er ingen model, der passer til ethvert forskningsspørgsmål17. Brug af TMEV-modellen er især interessant, hvis de disponerende faktorer for anfaldsudvikling efter en infektion i CNS undersøges, eller hvis forbindelser screenes for deres antibeslaglæggelseseffektivitet.
Siden TMEV-modellen er blevet etableret og brugt på tværs af flere forskellige laboratorier internationalt, har forfatterne identificeret mange detaljer, der muliggør en vellykket implementering af modellen, f.eks. specificiteten af forskellige virus- og musestammer. Den mest pålidelige anfaldsinduktion blev genereret med Daniels stamme af TMEV- og B6J-mus 2,5,6,8,9. Modellen bruges i øjeblikket af National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) som en platform til at identificere nye lægemidler mod epilepsi og anfald18,19. Dette papir indeholder den detaljerede protokol for virusinduktion og klinisk overvågning for at give andre forskere mulighed for at udnytte denne model af viral encephalitis til at fremme forståelsen af sygdomsmekanismerne såvel som til lægemiddeltestning.
Følgende protokol afspejler en undersøgelse designet til sammensat test i denne model, selvom mange andre typer undersøgelser kan udføres. Mus bedøves kort før injektion med Daniels stamme af TMEV i den tidsmæssige region af højre halvkugle (bageste og mediale til højre øje). Afhængigt af forskningsspørgsmålet, hvis ikke-inficerede kontroldyr er påkrævet, modtager mus sterilt fosfatbufret saltvand (PBS, pH 7,4, inklusive KH 2 PO 4 [1,06 mM], NaCl [155,17 mM] og Na 2 HPO4 · 7H 2 O [2,97mM]) i stedetfor TMEV. Tidligere erfaringer med TMEV-inficerede mus har indikeret, at håndteringsinducerede anfald forekommer mellem dag 3 og dag 7 efter infektion. Hyppigheden af injektionen, ruten og tidspunktet for testning af eksperimentelle forbindelser varierer alt efter deres egenskaber. Det anbefales at udføre viruspodningen på en fredag, hvilket gør det muligt for dag 3-7 anfaldsovervågning at ske den følgende uge, mandag-fredag. I løbet af anfaldsovervågningsugen kan eksperimentelle forbindelser administreres (i.p.) to gange dagligt (mindst 4 timer fra hinanden), medmindre andet er foreslået af forbindelsens kinetik eller virkningsmekanisme. Anfaldsovervågning under behandlingen kan udføres på et tidligere bestemt tidspunkt. Injektions- og observationstider varierer afhængigt af individuelle forbindelser. Dyr injiceres med testforbindelsen eller med et køretøj i stedet for lægemiddelforbindelsen. Disse to grupper kan håndteres og observeres analogt med den eksperimentelle gruppe. Under forsøget skal den ene person, der håndterer musene og scorer anfaldene, blindes for behandlingen.
Dette er den første infektionsbaserede gnavermodel for epilepsi, der muliggør undersøgelse af akut og kronisk anfaldsudvikling. Det vil hjælpe med at identificere lægemiddelmål og nye forbindelser til sygdomsforebyggelse eller modifikation for en af de mest almindelige ætiologier af epilepsi.
Som beskrevet ovenfor kan det være nødvendigt nøje at overveje batchen og virustiteren for at sikre, at en tilstrækkelig andel af TMEV-behandlede mus udviser håndteringsinducerede anfald. Hvis dyr har færre anfald end normalt, skal du bruge et parti N = 20 dyr for at kontrollere viruseffektiviteten. Hvis aktiviteten er nedsat (mindre end 50%), er det tid til at lave nye alikvoter og teste dem med N = 20 dyr. Hvis de nye delprøver ikke er mere effektive, bør et nyt parti af virusset renses. For nogle transgene muselinjer kan det være nødvendigt at bruge en lavere viral titer; Derfor bør den virale titer fortyndes efter behov efter indledende forsøg. De fleste tilgængelige data om B6-mus stammer fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA eller Charles River, Sulzfeld, Tyskland); lignende anfaldsrater hos B6-mus fra Harlan (Eystrup, Tyskland) er imidlertid blevet bekræftet8. Beslaglæggelsesrater for transgene dyr med B6-baggrund kan sammenlignes med vildtype B6-mus, men kan variere, hvis de genetiske ændringer har indflydelse på virusinvasion, inflammatorisk respons eller neurodegeneration21. Akutte anfald observeres spontant, men udløses af håndtering og støj, så det er yderst vigtigt at håndtere alle dyr på samme måde, når beslaglæggelsesraterne sammenlignes. To gange daglig håndtering har tidligere givet en høj anfaldsbyrde og en større andel af mus, der udviser anfald på dag 3-7 efter infektion 6,8,19. Yderligere håndteringssessioner (dag 1 og dag 2) kan også anvendes til at øge anfaldsbyrden. Desuden kan dyr observeres før hver håndteringssession for at sikre, at spontane anfald ikke forekommer. Et højt laboratoriemiljø kan for eksempel producere anfald, hvilket igen kan gøre dyr ildfaste over for håndteringsinducerede anfald under testtider.
Mens TMEV-infektion producerer håndteringsinducerede anfald hos de fleste mus, er det ukendt, hvorfor nogle dyr er resistente over for denne behandling. Som beskrevet ovenfor kan det være, at elektrografiske anfald (med minimal eller ingen tilknyttet adfærd) forekommer og normalt ikke kvantificeres uden samtidig EEG-optagelse. Det kan også være, at små forskelle i injektionssted letter reduceret viral effekt i hjernen; Imidlertid er anfald blevet rapporteret efter kortikal og striatal infektion 5,6,8,9 på grund af virusets tropisme til hippocampus. For lægemiddelscreeningsundersøgelser i denne model kræves der et større antal dyr for hver gruppe (f.eks. N = 20) for at identificere en reduktion i anfald (f.eks. N = 20). Desuden nødvendiggør variabiliteten i anfaldsadfærd i denne model større forskelle i narkotika vs. køretøjseffekter for at identificere en signifikant anfaldsreduktion. Derfor er en begrænsning ved denne model kravet om større gruppestørrelser. Ikke desto mindre giver tilstrækkelige gruppestørrelser også mulighed for identifikation af anti-beslaglæggelse og antiinflammatoriske virkninger i denne model19.
Langt de fleste observerbare anfald i denne model forekommer i den akutte infektionsperiode. På trods af forekomsten af hippocampus degeneration, immuncelleaktivering og kognitive underskud observeret hos mus behandlet med TMEV, udvikler kun en lille del af de behandlede dyr til sidst kroniske, spontane anfald. Denne lave samlede anfaldsbyrde ville kræve et stort antal inficerede mus for korrekt at studere spontane anfald i denne model, hvilket ligger uden for mange projekters omfang og kapacitet. Dybdeelektrodeimplantation og EEG-overvågning vil også øge byrden for forsøgsdyrene. Mens dybdeelektroder kan hjælpe med at identificere spontan anfaldsaktivitet, kan ændringer i hippocampus anatomi efter infektion gøre konsekvent elektrodeplacering til en udfordring.
Det presserende behov for at identificere nye behandlinger for epilepsi kræver udvikling af modeller, der kan bruges som en hurtig screeningsmetode for antibeslaglæggelseseffekt. Denne model indeholder funktioner til at imødekomme denne presserende anmodning. Desuden gør det faktum, at det ikke kræver nogen stereotaktisk kirurgi, det til en passende og nem at udføre model til undersøgelse af antibeslaglæggelsesforbindelser.
The authors have nothing to disclose.
SB støttes af et starttilskud fra FU Berlin. KSW er støttet af R37 NS065434 og ALSAM Foundation. LAB er støttet af en D-SPAN pris 1F99NS125773-01. Vi takker Robert Fujinami, Ph.D. for at give os Theiler-virussen og University of Utah Cell Imaging Core Facility til mikroskopistøtte.
Absorbent paper | – | – | any |
Analytical balance | Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) | 30216542 | 0. 1 mg–220 g |
Animal balance | Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) | STX2202 | 0.01 g–2200 g |
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD (Mississauga, ON, Canada) | BD329461 | Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle – 1 mL |
Daniel's strain of TMEV | kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) | – | 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s) |
Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super | Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany | – | Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol |
Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 22-363-750 | |
Fluriso | VETone (Boise, ID, U.S.A) | 502017 | Isoflurane 250 mL, 2%–5% |
Fume absorber | Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) | – | – |
General Protection Disposable SMS White Lab Coats | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 17-100-810A | |
GraphPad Prism version 9 | (La Jolla, CA, U.S.A.) | ||
Ice bucket | – | – | any |
Microsoft Excel Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
Microsoft Word Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
Mouse cage | – | – | any mouse cage holding at least 5 mice |
PrecisionGlide needles | BD (Mississauga, ON, Canada) | 329652 | BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes – 26 G x 3/8 – 0.45 mm x 10 mm |
Self-Sealing Sterilizing Pouch | Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) | NC9241087 | 12.6 x 25.5 cm |
Small glass flask | – | – | any, volume 25 mL |
sterile PBS | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 10010056 | |
Stir bar | Carl Roth GmbH & CO. KG | X171.1 | size according to volume of solution |
Stir plate | Carl Roth GmbH & CO. KG | AAN2.1 | |
Syringe Luer-Lok | BD (Mississauga, ON, Canada) | 309628 | 1 mL syringe only |
Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer | Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) | EW-08895-23 | Bath sonicator – 0.5 gal, 115 V |
Vehicle solution | – | – | depending on compound vehicle |
Vortex REAX | Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany | 541-10000-00 |