C57BL/6 마우스에서 Theiler’s murine encephalomyelitis virus(TMEV)에 의한 뇌내 감염은 인간 환자에서 바이러스성 뇌염 및 후속 간질의 초기 및 만성 임상 증상의 많은 부분을 복제합니다. 이 논문은 TMEV 모델의 바이러스 감염, 증상 및 조직병리학에 대해 설명합니다.
간질의 주요 원인 중 하나는 중추 신경계 (CNS)의 감염입니다. 이러한 감염에서 살아남은 환자의 약 8 %가 결과적으로 간질을 앓고 있으며, 경제적으로 덜 발달 된 국가에서는 그 비율이 훨씬 높습니다. 이 작업은 감염 병인의 간질을 모델링하고 이를 새로운 항발작 화합물 테스트를 위한 플랫폼으로 사용하는 개요를 제공합니다. C57BL/6 마우스에서 Theiler의 쥐 뇌척수염 바이러스(TMEV)의 비정위 뇌내 주사에 의한 간질 유도 프로토콜이 제시되며, 이는 인간 환자에서 바이러스성 뇌염 및 후속 간질의 초기 및 만성 임상 증상의 많은 부분을 복제합니다. 발작 활성을 모니터링하고 새로운 화합물의 잠재적인 항발작 효과를 검출하기 위한 뇌염 동안 마우스의 임상적 평가가 설명된다. 또한, 바이러스성 뇌염 및 해마 손상 및 신경염증과 같은 발작의 조직병리학적 결과뿐만 아니라 자발적인 간질 발작과 같은 장기적인 결과가 나타납니다. TMEV 모델은 CNS 감염의 결과로 간질 발병 메커니즘을 조사할 수 있는 최초의 번역, 감염 중심, 실험 플랫폼 중 하나입니다. 따라서 CNS 감염 후 간질 발병 위험이 있는 환자에 대한 잠재적인 치료 표적 및 화합물을 식별하는 역할도 합니다.
바이러스 성 뇌염의 빈번한 결과 중 하나는 간질 발작입니다. 많은 바이러스 감염은 감염의 급성기에 증상 발작을 유발합니다. 이러한 발작의 위험은 일반 대중에서 20 % 이상 증가합니다 1,2,3. 감염에서 살아남은 환자는 감염 후 수개월에서 수년 내에 만성 간질 발병 위험이 4%-20% 증가한다 1,4. Theiler’s murine encephalomyelitis virus(TMEV)는 바이러스성 뇌염의 마우스 모델에서 급성 및 만성 발작을 연구하기에 적합한 바이러스로 확인되었다 5,6,7. TMEV는 Picornaviridae 계통의 외피가 없는 포지티브 센스 단일 가닥 RNA 바이러스이며 전통적으로 SJL 마우스의 척수에서 탈수초화를 연구하는 데 사용되어 왔으며, C57BL/6(B6) 마우스는 감염 후 바이러스를 빠르게 제거할 수 있는 능력이 있기 때문에 보호됩니다. 그러나, TMEV는 감염 후 첫 주 (pi) 이내에 수컷 및 암컷 B6 마우스의 50%-75%에서 급성 발작을 유도하는 반면, 약 25%-40%는 pi 2,5,6,8,9에서 몇 주에서 몇 달 동안 만성 간질이 발생합니다. 발작 외에도, 마우스는 또한 신경 변성 및 gliosis를 갖는 간질 해마의 일반적인 조직 병리학을 나타낸다 5,6,8,10,11,12. 또한, TMEV에 감염된 B6 마우스는 학습 및 기억에 대한 행동 테스트에서 유의하게 더 나쁜 성능을 보이며 간질이 있는 임상 환자에서도 볼 수 있는 인지 동반이환이 있습니다13,14,15.
전통적으로 간질 및 발작 모델은 발작을 유도하기 위해 화학 경련 물질 또는 전기 자극을 사용합니다. 그러나, 이들 모델은 구조적 타당성이 결여되어 있으며, 종종 임상환자에서 볼 수 있는 것보다 더 심각한 발작과 뇌손상을 나타낸다16. 모든 연구 질문에 적합한 모델은 없습니다17. TMEV 모델을 사용하는 것은 CNS 감염 후 발작 발생의 소인 요인을 연구하거나 화합물이 항발작 효율에 대해 스크리닝되는 경우 특히 흥미로울 것입니다.
TMEV 모델이 국제적으로 여러 실험실에서 확립되고 사용되었기 때문에 저자는 모델을 성공적으로 구현할 수 있는 많은 세부 사항(예: 다양한 바이러스 및 마우스 균주의 특이성)을 확인했습니다. 가장 신뢰할 수 있는 발작 유도는 TMEV 및 B6J 마우스 2,5,6,8,9의 Daniel’s 균주를 사용하여 생성되었습니다. 이 모델은 현재 NINDS(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)에서 간질 및 발작에 대한 신약을 식별하는 플랫폼으로 사용되고 있습니다18,19. 이 논문에는 다른 연구자들이 이 바이러스성 뇌염 모델을 활용하여 질병 메커니즘에 대한 이해를 높이고 약물 테스트를 수행할 수 있도록 하는 바이러스 유도 및 임상 모니터링에 대한 자세한 프로토콜이 포함되어 있습니다.
다음 프로토콜은 이 모델에서 화합물 테스트를 위해 설계된 연구를 반영하지만 수많은 다른 유형의 연구를 수행할 수 있습니다. 마우스는 주사 전에 우반구의 측두엽 영역(오른쪽 눈의 후방 및 내측)에 Daniel’s strain TMEV를 주사하기 전에 잠시 마취됩니다. 연구 질문에 따라 감염되지 않은 대조군 동물이 필요한 경우 마우스는 TMEV 대신 멸균 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4, KH2PO4[1.06mM], NaCl[155.17mM] 및 Na2HPO4·7H2O[2.97mM])를 받습니다. TMEV에 감염된 마우스에 대한 이전 경험에 따르면 취급 유발 발작은 감염 후 3일과 7일 사이에 발생합니다. 실험 화합물의 주입 빈도, 경로 및 테스트 시간은 특성에 따라 다릅니다. 다음 주 월요일-금요일에 3-7일 발작 모니터링을 수행할 수 있는 금요일에 바이러스 접종을 수행하는 것이 좋습니다. 발작 모니터링 주간 동안, 실험 화합물은 화합물의 동역학 또는 작용 메카니즘에 의해 달리 제시되지 않는 한 1일 2회(적어도 4시간 간격) 투여될 수 있다. 치료 중 발작 모니터링은 이전에 결정된 시점에서 수행될 수 있다. 주입 및 관찰 시간은 개별 화합물에 따라 다릅니다. 동물에게 시험 화합물 또는 약물 화합물 대신 비히클을 주사한다. 이 두 그룹은 실험 그룹과 유사하게 취급하고 관찰할 수 있습니다. 실험 동안, 마우스를 다루고 발작을 채점하는 한 사람은 치료에 대해 눈이 멀어야 한다.
이것은 급성 및 만성 발작 발달을 조사할 수 있는 간질에 대한 최초의 감염 기반 설치류 모델입니다. 간질의 가장 흔한 원인 중 하나에 대한 질병 예방 또는 변형을 위한 약물 표적 및 새로운 화합물을 식별하는 데 도움이 될 것입니다.
전술한 바와 같이, TMEV-처리된 마우스의 적절한 비율이 취급-유도된 발작을 나타내도록 하기 위해 배치 및 바이러스 역가에 대한 신중한 고려가 필요할 수 있다. 동물이 평소보다 발작이 적은 경우 N = 20 마리의 동물 배치를 사용하여 바이러스 효율을 확인하십시오. 활성이 감소하면 (50 % 미만) 새로운 부분 표본을 만들고 N = 20 마리의 동물로 테스트 할 때입니다. 새로운 부분 표본이 더 효율적이지 않으면 바이러스의 새로운 배치를 정제해야합니다. 일부 형질전환 마우스 라인의 경우 더 낮은 바이러스 역가를 사용해야 할 수도 있습니다. 따라서 바이러스 역가는 예비 실험 후 필요에 따라 희석해야 합니다. B6 마우스에서 이용 가능한 대부분의 데이터는 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA 또는 Charles River, Sulzfeld, Germany)에서 유래했습니다. 그러나, Harlan(Eystrup, Germany)으로부터 얻은 B6 마우스에서도 유사한 발작률이 확인되었다8. B6 배경을 가진 형질전환 동물의 발작률은 야생형 B6 마우스와 비슷하지만 유전적 변화가 바이러스 침입, 염증 반응 또는 신경변성에 영향을 미치는 경우 다를 수 있다21. 급성 발작은 자발적으로 관찰되지만 취급 및 소음에 의해 유발되므로 발작률을 비교할 때 모든 동물을 유사한 방식으로 처리하는 것이 가장 중요합니다. 1일 2회 취급 세션은 이전에 높은 발작 부담을 제공했으며 감염후 3-7일 동안 발작을 나타내는 마우스의 비율이 더 높았습니다 6,8,19. 발작 부담을 증가시키기 위해 추가 처리 세션(1일 및 2일)을 사용할 수도 있습니다. 또한, 자연 발작이 발생하지 않도록 각 취급 세션 전에 동물을 관찰 할 수 있습니다. 예를 들어, 시끄러운 실험실 환경은 발작을 일으킬 수 있으며, 이로 인해 동물은 테스트 시간 동안 취급으로 인한 발작에 불응 할 수 있습니다.
TMEV 감염은 대부분의 마우스에서 취급 유발 발작을 일으키지만 일부 동물이 이 치료에 내성이 있는 이유는 알려져 있지 않습니다. 상술한 바와 같이, 전자적 발작(관련 행동이 최소화되거나 전혀 없음)이 발생할 수 있으며 수반되는 EEG 기록 없이는 정상적으로 정량화되지 않습니다. 또한 주사 위치의 작은 차이가 뇌의 바이러스 효과 감소를 촉진 할 수도 있습니다. 그러나 피질 및 선조체 감염후 발작이 보고되었습니다 5,6,8,9 해마에 대한 바이러스의 친화성으로 인해. 이 모델에서의 약물 스크리닝 연구의 경우, 발작의 감소(예를 들어, 발작 부담의 50% 감소)를 확인하기 위해, 각 그룹에 대해 더 많은 수의 동물이 필요하다 (예를 들어, N=20). 또한, 이 모델에서 발작 행동의 가변성은 상당한 발작 감소를 식별하기 위해 약물 대 비히클 효과의 더 큰 차이를 필요로 합니다. 따라서 이 모델의 한 가지 제한 사항은 더 큰 그룹 크기에 대한 요구 사항입니다. 그럼에도 불구하고, 충분한 그룹 크기는 또한 이 모델19에서 항발작 및 항염증 효과의 식별을 허용한다.
이 모델에서 관찰 가능한 발작의 대부분은 급성 감염 기간 동안 발생합니다. TMEV로 치료한 마우스에서 관찰된 해마 변성, 면역 세포 활성화 및 인지 장애의 발생에도 불구하고, 치료받은 동물의 극히 일부만이 결국 만성적이고 자발적인 발작을 일으킵니다. 이 낮은 전체 발작 부담은 이 모델에서 자발적인 발작을 적절하게 연구하기 위해 많은 수의 감염된 마우스를 필요로 하며, 이는 많은 프로젝트의 범위와 능력을 벗어납니다. 깊이 전극 이식 및 EEG 모니터링은 또한 실험 동물에 대한 부담을 증가시킬 것입니다. 깊이 전극은 자발적인 발작 활동을 식별하는 데 도움이 될 수 있지만 감염 후 해마 해부학의 변화는 일관된 전극 배치를 어렵게 만들 수 있습니다.
간질에 대한 새로운 치료법을 식별하는 것이 시급하기 때문에 항경련 효능에 대한 빠른 스크리닝 방법으로 사용할 수 있는 모델의 개발이 필요합니다. 이 모델은 이러한 긴급한 요청을 처리하는 기능을 제공합니다. 또한, 정위 수술이 필요하지 않다는 사실은 항발작 화합물 조사에 적합하고 수행하기 쉬운 모델입니다.
The authors have nothing to disclose.
SB는 FU Berlin의 시작 보조금으로 지원됩니다. KSW는 R37 NS065434 및 ALSAM 재단의 지원을 받습니다. LAB은 D-SPAN 어워드 1F99NS125773-01의 지원을 받습니다. Theiler 바이러스와 현미경 지원을 위한 University of Utah Cell Imaging Core Facility를 제공해 주신 Robert Fujinami 박사에게 감사드립니다.
Absorbent paper | – | – | any |
Analytical balance | Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) | 30216542 | 0. 1 mg–220 g |
Animal balance | Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) | STX2202 | 0.01 g–2200 g |
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD (Mississauga, ON, Canada) | BD329461 | Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle – 1 mL |
Daniel's strain of TMEV | kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) | – | 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s) |
Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super | Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany | – | Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol |
Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 22-363-750 | |
Fluriso | VETone (Boise, ID, U.S.A) | 502017 | Isoflurane 250 mL, 2%–5% |
Fume absorber | Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) | – | – |
General Protection Disposable SMS White Lab Coats | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 17-100-810A | |
GraphPad Prism version 9 | (La Jolla, CA, U.S.A.) | ||
Ice bucket | – | – | any |
Microsoft Excel Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
Microsoft Word Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
Mouse cage | – | – | any mouse cage holding at least 5 mice |
PrecisionGlide needles | BD (Mississauga, ON, Canada) | 329652 | BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes – 26 G x 3/8 – 0.45 mm x 10 mm |
Self-Sealing Sterilizing Pouch | Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) | NC9241087 | 12.6 x 25.5 cm |
Small glass flask | – | – | any, volume 25 mL |
sterile PBS | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 10010056 | |
Stir bar | Carl Roth GmbH & CO. KG | X171.1 | size according to volume of solution |
Stir plate | Carl Roth GmbH & CO. KG | AAN2.1 | |
Syringe Luer-Lok | BD (Mississauga, ON, Canada) | 309628 | 1 mL syringe only |
Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer | Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) | EW-08895-23 | Bath sonicator – 0.5 gal, 115 V |
Vehicle solution | – | – | depending on compound vehicle |
Vortex REAX | Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany | 541-10000-00 |