Intracerebral infektion med Theilers murina encefalomyelitvirus (TMEV) hos C57BL / 6-möss replikerar många av de tidiga och kroniska kliniska symtomen på viral encefalit och efterföljande epilepsi hos mänskliga patienter. Detta dokument beskriver virusinfektion, symtom och histopatologi för TMEV-modellen.
En av de främsta orsakerna till epilepsi är en infektion i centrala nervsystemet (CNS); Cirka 8% av patienterna som överlever en sådan infektion utvecklar epilepsi som en konsekvens, med priser som är betydligt högre i mindre ekonomiskt utvecklade länder. Detta arbete ger en översikt över modellering av epilepsi av infektiös etiologi och användning av den som en plattform för nya tester av anfallsmedel. Ett protokoll för epilepsiinduktion genom icke-stereotaktisk intracerebral injektion av Theilers murina encefalomyelitvirus (TMEV) hos C57BL/6-möss presenteras, vilket replikerar många av de tidiga och kroniska kliniska symtomen på viral encefalit och efterföljande epilepsi hos mänskliga patienter. Den kliniska utvärderingen av möss under encefalit för att övervaka anfallsaktivitet och upptäcka de potentiella antianfallseffekterna av nya föreningar beskrivs. Vidare visas histopatologiska konsekvenser av viral encefalit och anfall såsom hippocampus skada och neuroinflammation, liksom långsiktiga konsekvenser såsom spontana epileptiska anfall. TMEV-modellen är en av de första translationella, infektionsdrivna, experimentella plattformarna som möjliggör undersökning av mekanismerna för epilepsiutveckling som en följd av CNS-infektion. Således tjänar det också till att identifiera potentiella terapeutiska mål och föreningar för patienter som riskerar att utveckla epilepsi efter en CNS-infektion.
En av de frekventa konsekvenserna av viral encefalit är epileptiska anfall. Många virusinfektioner utlöser symptomatiska anfall under infektionens akuta fas; Risken för sådana beslag ökar med över 20% bland allmänheten 1,2,3. Patienter som överlever infektionen har också en ökad risk på 4% -20% att utveckla kronisk epilepsi under månaderna till åren efter infektion 1,4. Theilers murina encefalomyelitvirus (TMEV) har identifierats som ett lämpligt virus för att studera akuta och kroniska anfall i en musmodell av viral encefalit 5,6,7. TMEV är ett icke-höljet, enkelsträngat RNA-virus med positiv känsla av familjen Picornaviridae och har traditionellt använts för att studera demyelinisering i ryggmärgen hos SJL-möss, som C57BL / 6 (B6) möss skyddas från eftersom de har förmågan att rensa viruset snabbt efter infektion. TMEV inducerar dock akuta anfall hos 50% -75% av manliga och kvinnliga B6-möss inom den första veckan efter infektion (pi), medan cirka 25% -40% utvecklar kronisk epilepsi veckor till månader pi 2,5,6,8,9. Förutom anfall visar mössen också den gemensamma histopatologin för en epileptisk hippocampus med neurodegeneration och glios 5,6,8,10,11,12. Dessutom presterar TMEV-infekterade B6-möss signifikant sämre i beteendetester för inlärning och minne och har kognitiv komorbiditet, vilket också ses hos kliniska patienter med epilepsi13,14,15.
Traditionellt använder modeller av epilepsi och anfall antingen applicering av kemokonvulsiva ämnen eller elektrisk stimulering för att inducera anfall; Dessa modeller saknar dock konstruktionsvaliditet och uppvisar ofta allvarligare anfall och hjärnskador än vad som ses hos kliniska patienter16. Det finns ingen modell som är lämplig för varje forskningsfråga17. Att använda TMEV-modellen är särskilt intressant om de predisponerande faktorerna för anfallsutveckling efter en infektion i CNS undersöks eller om föreningar screenas för deras antianfallseffektivitet.
Eftersom TMEV-modellen har etablerats och använts i flera olika laboratorier internationellt har författarna identifierat många detaljer som möjliggör framgångsrik implementering av modellen, t.ex. specificiteten hos olika virus- och musstammar. Den mest tillförlitliga anfallsinduktionen genererades med Daniels stam av TMEV- och B6J-möss 2,5,6,8,9. Modellen används för närvarande av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) som en plattform för att identifiera nya läkemedel mot epilepsi och anfall18,19. Detta dokument innehåller det detaljerade protokollet för virusinduktion och klinisk övervakning för att tillåta andra forskare att använda denna modell av viral encefalit för att främja förståelsen av sjukdomsmekanismerna, liksom för läkemedelstestning.
Följande protokoll återspeglar en studie utformad för sammansatt testning i denna modell, även om många andra typer av studier kan utföras. Möss bedövas kort före injektion med Daniels stam av TMEV i den tidiga regionen på höger halvklot (bakre och mediala till höger öga). Beroende på forskningsfrågan, om icke-infekterade kontrolldjur krävs, får möss steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4, inklusive KH 2 PO 4 [1,06 mM], NaCl [155,17 mM] och Na 2 HPO4 · 7H 2 O [2,97mM]) istället för TMEV. Tidigare erfarenhet av TMEV-infekterade möss har indikerat att hanteringsinducerade anfall inträffar mellan dag 3 och dag 7 efter infektion. Frekvensen för injektion, administreringsväg och tid för testning av experimentella föreningar varierar beroende på deras egenskaper. Det rekommenderas att utföra virusinokulering på en fredag, vilket gör att dag 3-7 anfallsövervakning kan ske följande vecka, måndag-fredag. Under anfallsövervakningsveckan kan experimentella föreningar administreras (i.p.) två gånger dagligen (med minst 4 timmars mellanrum) om inte föreningens kinetik eller verkningsmekanism föreslår något annat. Anfallsövervakning under behandlingen kan utföras vid en tidigare bestämd tidpunkt. Injektions- och observationstiderna varierar beroende på enskilda föreningar. Djur injiceras med testföreningen eller med ett vehikel i stället för läkemedelsföreningen. Dessa två grupper kan hanteras och observeras analogt med experimentgruppen. Under experimentet bör den person som hanterar mössen och poängsätter anfallen vara blindad för behandlingen.
Detta är den första infektionsbaserade gnagarmodellen för epilepsi som möjliggör utredning av akut och kronisk anfallsutveckling. Det kommer att bidra till att identifiera läkemedelsmål och nya föreningar för förebyggande eller modifiering av sjukdomar för en av de vanligaste etiologierna för epilepsi.
Som beskrivits ovan kan det vara nödvändigt att noggrant överväga sats och virustiter för att säkerställa att en tillräcklig andel TMEV-behandlade möss uppvisar hanteringsinducerade anfall. Om djur har färre anfall än vanligt, använd en sats N = 20 djur för att verifiera virusets effektivitet. Om dess aktivitet minskar (mindre än 50%) är det dags att göra nya alikvoter och testa dem med N = 20 djur. Om de nya alikvoterna inte är effektivare bör en ny sats av viruset renas. För vissa transgena muslinjer kan det vara nödvändigt att använda en lägre viral titer; Därför bör virustitern spädas efter behov efter preliminära experiment. De flesta tillgängliga data om B6-möss härstammar från Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA eller Charles River, Sulzfeld, Tyskland); Liknande anfallsfrekvenser hos B6-möss från Harlan (Eystrup, Tyskland) har dock bekräftats8. Anfallsfrekvensen hos transgena djur med B6-bakgrund är jämförbar med vildtyp B6-möss men kan skilja sig om de genetiska förändringarna påverkar virusinvasion, inflammatoriskt svar eller neurodegeneration21. Akuta anfall observeras spontant men utlöses av hantering och buller, så det är av yttersta vikt att hantera alla djur på ett likartat sätt när anfallsfrekvensen jämförs. Behandlingssessioner två gånger dagligen har tidigare gett en hög anfallsbörda och en större andel möss som uppvisar anfall under dag 3-7 efter infektion 6,8,19. Ytterligare hanteringssessioner (dag 1 och dag 2) kan också användas för att öka anfallsbördan. Vidare kan djur observeras före varje hanteringssession för att säkerställa att spontana anfall inte uppstår. En högljudd laboratoriemiljö kan till exempel producera anfall, vilket i sin tur kan göra djur eldfasta mot hanteringsinducerade anfall under testtider.
Medan TMEV-infektion ger hanteringsinducerade anfall hos majoriteten av möss, är det okänt varför vissa djur är resistenta mot denna behandling. Som beskrivits ovan kan det vara så att elektrografiska anfall (med minimala eller inga associerade beteenden) inträffar och normalt inte kvantifieras utan samtidig EEG-registrering. Det kan också vara så att små skillnader i injektionsställe underlättar minskad viral effekt i hjärnan; Kramper har dock rapporterats efter kortikal och striatal infektion 5,6,8,9 på grund av tropism av viruset till hippocampus. För läkemedelsscreeningstudier i denna modell, för att identifiera en minskning av anfall (t.ex. en 50% minskning av anfallsbördan), krävs ett större antal djur för varje grupp (t.ex. N = 20). Dessutom kräver variationen i anfallsbeteenden i denna modell större skillnader i läkemedels- kontra fordonseffekter för att identifiera en signifikant anfallsminskning. Därför är en begränsning med denna modell kravet på större gruppstorlekar. Icke desto mindre möjliggör tillräckliga gruppstorlekar också identifiering av anti-anfall och antiinflammatoriska effekter i denna modell19.
De allra flesta observerbara anfall i denna modell inträffar under den akuta infektionsperioden. Trots förekomsten av hippocampus degeneration, immuncellsaktivering och kognitiva underskott observerade hos möss behandlade med TMEV, utvecklar endast en liten del av de behandlade djuren så småningom kroniska, spontana anfall. Denna låga totala anfallsbörda skulle kräva ett stort antal infekterade möss för att korrekt studera spontana anfall i denna modell, vilket ligger utanför omfattningen och förmågan hos många projekt. Djupelektrodimplantation och EEG-övervakning skulle också öka belastningen på försöksdjuren. Medan djupelektroder kan hjälpa till att identifiera spontan anfallsaktivitet, kan förändringar i hippocampus anatomi efter infektion göra konsekvent elektrodplacering till en utmaning.
Det akuta behovet av att identifiera nya behandlingar för epilepsi kräver utveckling av modeller som kan användas som en snabb screeningmetod för anfallseffekt. Den här modellen innehåller funktioner för att hantera denna brådskande begäran. Dessutom gör det faktum att det inte kräver någon stereotaktisk kirurgi det till en lämplig och lätt att utföra modell för undersökning av antibeslagsföreningar.
The authors have nothing to disclose.
SB stöds av ett startbidrag från FU Berlin. KSW stöds av R37 NS065434 och ALSAM Foundation. LAB stöds av en D-SPAN-utmärkelse 1F99NS125773-01. Vi tackar Robert Fujinami, Ph.D. för att ge oss Theiler-viruset och University of Utah Cell Imaging Core Facility för mikroskopistöd.
Absorbent paper | – | – | any |
Analytical balance | Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) | 30216542 | 0. 1 mg–220 g |
Animal balance | Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) | STX2202 | 0.01 g–2200 g |
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD (Mississauga, ON, Canada) | BD329461 | Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle – 1 mL |
Daniel's strain of TMEV | kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) | – | 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s) |
Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super | Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany | – | Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol |
Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 22-363-750 | |
Fluriso | VETone (Boise, ID, U.S.A) | 502017 | Isoflurane 250 mL, 2%–5% |
Fume absorber | Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) | – | – |
General Protection Disposable SMS White Lab Coats | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 17-100-810A | |
GraphPad Prism version 9 | (La Jolla, CA, U.S.A.) | ||
Ice bucket | – | – | any |
Microsoft Excel Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
Microsoft Word Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
Mouse cage | – | – | any mouse cage holding at least 5 mice |
PrecisionGlide needles | BD (Mississauga, ON, Canada) | 329652 | BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes – 26 G x 3/8 – 0.45 mm x 10 mm |
Self-Sealing Sterilizing Pouch | Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) | NC9241087 | 12.6 x 25.5 cm |
Small glass flask | – | – | any, volume 25 mL |
sterile PBS | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 10010056 | |
Stir bar | Carl Roth GmbH & CO. KG | X171.1 | size according to volume of solution |
Stir plate | Carl Roth GmbH & CO. KG | AAN2.1 | |
Syringe Luer-Lok | BD (Mississauga, ON, Canada) | 309628 | 1 mL syringe only |
Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer | Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) | EW-08895-23 | Bath sonicator – 0.5 gal, 115 V |
Vehicle solution | – | – | depending on compound vehicle |
Vortex REAX | Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany | 541-10000-00 |