Ved å kombinere viral vektortransduksjon og hjernerydding ved hjelp av CLARITY-metoden kan du undersøke et stort antall nevroner og astrocytter samtidig.
Ved å kombinere viral vektortransduksjon og vevsrydding ved hjelp av CLARITY-metoden, kan du samtidig undersøke flere typer hjerneceller og deres interaksjoner. Viral vektortransduksjon muliggjør merking av forskjellige celletyper i forskjellige fluorescensfarger i samme vev. Celler kan identifiseres genetisk ved aktivitet eller projeksjon. Ved hjelp av en modifisert CLARITY-protokoll har den potensielle prøvestørrelsen på astrocytter og nevroner vokst med 2-3 størrelsesordener. Bruken av CLARITY tillater avbildning av komplette astrocytter, som er for store til å passe i sin helhet i skiver, og undersøkelse av somata med alle sine prosesser. I tillegg gir det muligheten til å undersøke den romlige interaksjonen mellom astrocytter og forskjellige nevroncelletyper, nemlig antall pyramidale nevroner i hvert astrocytisk domene eller nærheten mellom astrocytter og spesifikke hemmende nevronpopulasjoner. Dette dokumentet beskriver i detalj hvordan disse metodene skal brukes.
De siste årene har kunnskapen om astrocyttfunksjon og hvordan de samhandler med nevronkretser økt dramatisk. Astrocytter kan påvirke plastisitet 1,2, bistå i nevronal postinjury utvinning 3,4, og til og med indusere de novo nevronal potensiering, med nyere studier som viser betydningen av astrocytter i minneoppkjøp og belønning, tidligere ansett som rent nevronale funksjoner 5,6,7 . Et trekk ved spesiell interesse for astrocyttforskning er det romlige arrangementet av cellene, som opprettholder unike romlige organisasjoner i hippocampus og andre hjernestrukturer 8,9,10. I motsetning til de nevronale dendrittene som blander seg mellom celle somata, beboer hippocampale astrocytter visuelt skille territorier med liten overlapping mellom prosessene sine, og skaper forskjellige domener 8,11,12,13. Bevisene som støtter deltakelse av astrocytter i nevronkretser støtter ikke mangelen på detaljert anatomisk beskrivelse av slike populasjoner og nevronene i deres domener14.
Virale vektortransduksjonsprosedyrer, sammen med transgene dyr (TG), har blitt popularisert som et verktøysett for å undersøke hjernestrukturer, funksjoner og celleinteraksjoner15,16. Bruken av forskjellige promotorer tillater målretting av spesifikke celler i henhold til deres genetiske egenskaper, aktiveringsnivåer17,18 eller projeksjonsmål. Ulike virus kan uttrykke forskjellige fargede fluoroforer i forskjellige populasjoner. Et virus kan kombineres med det endogene uttrykket av fluoroforer i TG, eller TG-dyr kan brukes uten behov for virus. Disse teknikkene er mye brukt til nevronmarkering, og noen laboratorier har begynt å bruke dem med modifikasjoner spesialisert for å målrette mot andre celletyper, for eksempel astrocytter 5,9,19.
CLARITY-teknikken, først beskrevet i 201320,21, muliggjør studiet av tykke hjerneskiver ved å gjøre hele hjernen gjennomsiktig mens du lar de mikroskopiske strukturene være intakte. Ved å kombinere de to metodene-viral vektortransduksjon og vev clearing-muligheten til å undersøke romlige interaksjoner mellom ulike celle type populasjoner er nå tilgjengelig. De fleste astrocytt-neuron interaksjonsstudier ble utført på tynne hjerneskiver, noe som resulterte i bilder av ufullstendige astrocytter på grunn av deres store domener, og dermed radikalt begrense antall analyserte celler. Bruken av CLARITY-teknikken tillater encellet oppløsningskarakterisering av cellepopulasjoner i store volumer samtidig. Avbildning av fluorescerende merkede cellepopulasjoner i klare hjerner gir ikke synaptisk oppløsning, men tillater grundig karakterisering av de romlige interaksjonene mellom astrocytter og en rekke nevronale celletyper.
Av den grunn utnyttet vi disse toppmoderne teknikkene for å undersøke egenskapene til astrocytter i hele dorsal CA1, og identifiserte alle lamina (Stratum Radiatum, pyramidelag og Stratum Oriens). Vi målte titusenvis av astrocytter (med viral penetrans på >96%5), og analyserte dermed informasjonen til hele den astrocytiske befolkningen rundt CA1. Med effektiv penetrans av nevronmarkørene kunne vi registrere interaksjonene mellom hele befolkningen i CA1 astrocytter og de fire typer nevronale celler-parvalbumin (PV), somatostatin (SST), VIP-hemmende nevroner og eksitatoriske pyramidale celler9.
Flere eksperimenter ble utført ved hjelp av en kombinasjon av fluorescens fra TG-dyr og forskjellige fargede virale vektorer (alle hemmende celler), mens andre (eksitatoriske) brukte to virale vektorer som uttrykte forskjellige fluoroforer under forskjellige promotorer9. Dette dokumentet presenterer en detaljert protokoll, inkludert merking av de ønskede cellene i hjernen, noe som gjør hjernen gjennomsiktig ved hjelp av en modifisert CLARITY-prosedyre, samt avbildning og analyse av komplette hjernestrukturer, ved hjelp av ulike prosedyrer og programvare.
Vevsryddingsmetoder presenterer et revolusjonerende verktøy i hjerneforskning, og inviterer spørsmål som ikke tidligere kunne ha blitt stilt. Fra å målrette egenskapene til en liten gruppe celler, en enkelt celle eller til og med en enkelt synapse, gjør CLARITY nå det mulig å målrette mot totale cellepopulasjoner eller langtrekkende tilkoblingsfunksjoner ved hjelp av relevante fluoroforer.
Utfallet av fluoroforuttrykket og CLARITY-prosedyrekombinasjonen er ikke binært; mange faktorer…
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet har fått støtte fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 (tilskuddsavtale Nr. 803589), Israel Science Foundation (ISF grant No. 1815/18) og Canada-Israel grants (CIHR-ISF, grant No. 2591/18). Vi takker Nechama Novick for å ha kommentert hele manuskriptet.
AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight – 61.83 g/mol |
Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
NaOH | Sigma | #S5881 | |
PBS | |||
PFA 4% | EMS | #15710 | |
RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
SDS | Sigma | #L3771 | |
SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight – 121.14 g/mol |
Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |