Genom att kombinera viral vektortransduktion och hjärnrensning med hjälp av CLARITY-metoden kan man undersöka ett stort antal nervceller och astrocyter samtidigt.
Genom att kombinera viral vektortransduktion och vävnadsrensning med hjälp av CLARITY-metoden kan man samtidigt undersöka flera typer av hjärnceller och deras interaktioner. Viral vektortransduktion möjliggör märkning av olika celltyper i olika fluorescensfärger inom samma vävnad. Celler kan identifieras genetiskt genom aktivitet eller projektion. Med hjälp av ett modifierat CLARITY-protokoll har den potentiella provstorleken för astrocyter och neuroner ökat med 2-3 storleksordningar. Användningen av CLARITY möjliggör avbildning av kompletta astrocyter, som är för stora för att passa i sin helhet i skivor, och undersökning av somata med alla sina processer. Dessutom ger det möjlighet att undersöka den rumsliga interaktionen mellan astrocyter och olika neuronala celltyper, nämligen antalet pyramidala neuroner i varje astrocytisk domän eller närheten mellan astrocyter och specifika hämmande neuronpopulationer. Detta dokument beskriver i detalj hur dessa metoder ska tillämpas.
Under de senaste åren har kunskapen om astrocytfunktion och hur de interagerar med neuronala kretsar ökat dramatiskt. Astrocyter kan påverka plasticitet 1,2, hjälpa till med neuronal återhämtning efter skada 3,4 och till och med inducera de novo neuronal potentiering, med nyligen genomförda studier som visar vikten av astrocyter vid minnesförvärv och belöning, som tidigare betraktades som rent neuronala funktioner 5,6,7 . En egenskap av särskilt intresse för astrocytforskning är cellernas rumsliga arrangemang, som upprätthåller unika rumsliga organisationer i hippocampus och andra hjärnstrukturer 8,9,10. Till skillnad från de neuronala dendriterna som sammanflätas mellan cellsomater, bor hippocampala astrocyter visuellt urskiljbara territorier med liten överlappning mellan deras processer, vilket skapar distinkta domäner 8,11,12,13. Bevisen som stöder astrocyternas deltagande i neuronala kretsar stöder inte bristen på detaljerad anatomisk beskrivning av sådana populationer och neuronerna i deras domäner14.
Virala vektortransduktionsförfaranden, tillsammans med transgena djur (TG), har populariserats som en verktygssats för att undersöka hjärnstrukturer, funktioner och cellinteraktioner15,16. Användningen av olika promotorer möjliggör inriktning av specifika celler enligt deras genetiska egenskaper, aktiveringsnivåer17,18 eller projektionsmål. Olika virus kan uttrycka olika färgade fluoroforer i olika populationer. Ett virus kan kombineras med det endogena uttrycket av fluoroforer i TG, eller TG-djur kan användas utan behov av virus. Dessa tekniker används ofta för neuronal märkning, och vissa laboratorier har börjat använda dem med modifieringar specialiserade för att rikta in sig på andra celltyper, såsom astrocyter 5,9,19.
CLARITY-tekniken, som först beskrevs 2013 20,21, möjliggör studier av tjocka hjärnskivor genom att göra hela hjärnan transparent samtidigt som de mikroskopiska strukturerna lämnas intakta. Genom att kombinera de två metoderna – viral vektortransduktion och vävnadsrensning – är möjligheten att undersöka de rumsliga interaktionerna mellan olika celltyppopulationer nu tillgänglig. De flesta astrocyt-neuroninteraktionsstudier utfördes på tunna hjärnskivor, vilket resulterade i bilder av ofullständiga astrocyter på grund av deras stora domäner, vilket radikalt begränsade antalet analyserade celler. Användningen av CLARITY-tekniken möjliggör encellsupplösningskarakterisering av cellpopulationer i storskaliga volymer samtidigt. Avbildning av fluorescerande märkta cellpopulationer i klara hjärnor ger inte synaptisk upplösning men möjliggör grundlig karakterisering av de rumsliga interaktionerna mellan astrocyter och en mängd olika neuronala celltyper.
Av den anledningen utnyttjade vi dessa toppmoderna tekniker för att undersöka egenskaperna hos astrocyter i hela dorsal CA1, avbildning av all lamina (Stratum Radiatum, pyramidal layer och Stratum Oriens). Vi mätte tiotusentals astrocyter (med viral penetrans på >96%5) och analyserade därmed informationen från hela den astrocytiska befolkningen runt CA1. Med effektiv penetrans av neuronala markörer kunde vi registrera interaktionerna mellan hela populationen av CA1-astrocyter och de fyra typerna av neuronala celler-parvalbumin (PV), somatostatin (SST), VIP-hämmande neuroner och excitatoriska pyramidala celler9.
Flera experiment utfördes med användning av en kombination av fluorescens från TG-djur och olikfärgade virusvektorer (alla hämmande celler), medan andra (excitatoriska) använde två virala vektorer som uttryckte olika fluoroforer under olika promotorer9. Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll, inklusive märkning av önskade celler i hjärnan, vilket gör hjärnan transparent med hjälp av ett modifierat CLARITY-förfarande, samt avbildning och analys av kompletta hjärnstrukturer, med hjälp av olika procedurer och programvara.
Vävnadsrensningsmetoder utgör ett revolutionerande verktyg inom hjärnforskningen och inbjuder till frågor som inte tidigare kunde ha ställts. Från att rikta in sig på egenskaperna hos en liten grupp celler, en enda cell eller till och med en enda synaps, möjliggör CLARITY nu inriktning på totala cellpopulationer eller långväga anslutningsfunktioner genom att använda relevanta fluoroforer.
Resultatet av kombinationen av fluoroforuttryck och CLARITY-procedur är inte binärt; många…
The authors have nothing to disclose.
Projektet har fått finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (bidragsavtal nr 803589), Israel Science Foundation (ISF-anslag nr 1815/18) och Kanada-Israel-bidragen (CIHR-ISF, anslag nr 2591/18). Vi tackar Nechama Novick för att han kommenterade hela manuskriptet.
AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight – 61.83 g/mol |
Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
NaOH | Sigma | #S5881 | |
PBS | |||
PFA 4% | EMS | #15710 | |
RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
SDS | Sigma | #L3771 | |
SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight – 121.14 g/mol |
Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |