Protokollen beskriver en metode for å introdusere kontrollerbart genetisk mangfold i hepatitt C-virusgenomet ved å kombinere full lengde mutant RNA-syntese ved hjelp av feilutsatt PCR og omvendt genetikk. Metoden gir en modell for fenotypeseleksjon og kan brukes til 10 kb lange positive sense RNA-virusgenomer.
Mangelen på en praktisk metode for iterativ generering av forskjellige virusvarianter i full lengde har hindret studiet av rettet evolusjon i RNA-virus. Ved å integrere en full RNA-genomfeilutsatt PCR og omvendt genetikk, kan tilfeldig genom-bred substitusjonsmutagenese induseres. Vi har utviklet en metode ved hjelp av denne teknikken for å syntetisere forskjellige biblioteker for å identifisere virale mutanter med fenotyper av interesse. Denne metoden, kalt full lengde mutant RNA-syntese (FL-MRS), gir følgende fordeler: (i) evnen til å lage et stort bibliotek via en svært effektiv ett-trinns feilutsatt PCR; (ii) evnen til å skape grupper av biblioteker med varierende nivåer av genetisk mangfold ved å manipulere troskapen til DNA-polymerase; (iii) opprettelsen av et full-lengde PCR-produkt som direkte kan tjene som en mal for mutant RNA-syntese; og (iv) evnen til å lage RNA som kan leveres inn i vertsceller som et ikke-valgt inngangsbasseng for å skjerme for virale mutanter av ønsket fenotype. Vi har funnet, ved hjelp av en omvendt genetikktilnærming, at FL-MRS er et pålitelig verktøy for å studere virusrettet evolusjon i alle stadier i livssyklusen til hepatitt C-viruset, JFH1-isolatet. Denne teknikken ser ut til å være et uvurderlig verktøy for å bruke rettet evolusjon for å forstå tilpasning, replikasjon og rollen som virale gener i patogenese og antiviral resistens i positiv forstand RNA-virus.
Fremskutt genetisk screening begynner med en viral fenotype av interesse, og deretter, gjennom sekvensering av genomet og sammenligning med den opprinnelige stammen, forsøker å identifisere mutasjonen (e) som forårsaker den fenotypen. I motsetning til dette, i omvendte genetiske skjermer, blir tilfeldige mutasjoner introdusert i et målgen, etterfulgt av en undersøkelse av den resulterende fenotypen (e)1. For omvendt genetikk tilnærming er in vitro mutagenese den mest brukte teknikken for å skape et basseng av varianter som deretter screenes for fenotyper av interesse. Ulike genetiske verktøy har blitt rapportert for å oppnå genom-bred tilfeldig mutagenese av RNA-virus, inkludert feilutsatt PCR (ep-PCR) 2,3, sirkulær polymeraseforlengelse4 og Mu-transposon innsetting mutagenese 5,6,7. De to sistnevnte metodene gir biblioteker som har begrenset sekvensmangfold og er utsatt for innføring av store innsettinger og slettinger, som er svært dødelige for virus og sterkt begrenser utvinningen av smittsomme virusvarianter.
ep-PCR er en velkjent kraftig mutageneseteknikk som er mye brukt i proteinteknikk for å generere mutante enzymer for valg av fenotyper med ønskede egenskaper, for eksempel forbedret termisk stabilitet, substratspesifisitet og katalytisk aktivitet 8,9,10. Denne teknikken er enkel å utføre fordi den krever enkelt utstyr, involverer ikke kjedelige manipulasjoner, bruker kommersielt tilgjengelige reagenser og er rask; Videre genererer det biblioteker av høy kvalitet.
Her utviklet vi en ny metode for full lengde mutant RNA-syntese (FL-MRS) for å generere komplette genomer av hepatitt C-virus (HCV) ved å integrere ep-PCR, som induserer tilfeldig genom-bred substitusjonsmutagenese og omvendt genetikk. Selv en enkelt nukleotidinnsetting eller sletting er svært skadelig for RNA-virus med positiv følelse ([+] ssRNA); Derfor er PCR-basert substitusjonsmutagenese den foretrukne metoden for iterativ generering av store, varierte biblioteker med fulle (+) ss RNA-virusgenomer med god levedyktighet.
FL-MRS er en enkel tilnærming som kan brukes på ethvert RNA-virus med positiv følelse med en ~ 10 kb genomlengde gjennom den omhyggelige utformingen av et primersett som binder seg til den virale cDNA-klonen. pJFH1 er en smittsom cDNA-klon som koder for HCV-genotype 2a og kan rekapitulere alle trinnene i virusets livssyklus. Ved å bruke FL-MRS-tilnærmingen demonstrerte vi syntesen av tilfeldig mutageniserte fullgenombiblioteker (mutantbiblioteker [MLs]) for å produsere replikasjonskompetente JFH1-varianter der det ikke var noen forkunnskaper om egenskapene forbundet med mutasjoner. Ved eksponering for et antiviralt middel overvant noen av virusvariantene raskt medikamenttrykket med ønsket fenotypisk forandring. Ved hjelp av protokollen beskrevet her, kan en mengde virusvarianter genereres, noe som skaper muligheter for å studere utviklingen av (+) ssRNA-virus.
I denne studien har vi beskrevet en enkel og rask FL-MRS-prosedyre som integrerer ep-PCR18 og omvendt genetikk for syntetisering av HCV-fullgenombiblioteker, som deretter kan brukes i et cellekultursystem for å generere replikasjonskompetente varianter for screening av stoffresistente fenotyper. Bruken av Taq DNA-polymerase med lav kvalitet er en forutsetning for ep-PCR som tillater inkorporering av substitusjoner under PCR-amplifisering av et viralt genom i full lengde. Vi testet flere Taq DNA-p…
The authors have nothing to disclose.
Finansieringsstøtte (tilskuddsnummer BT/PR10906/MED/29/860/2014) for denne studien ble gitt av Department of Biotechnology, Government of India.
1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
Acetic acid | Merck | A6283 | |
Agarose | HiMedia | MB080 | |
Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
dATP Solution | NEB | N0440S | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
LB broth | HiMedia | M1245 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
Methanol | Merck | 106009 | |
Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
Pipette controller | Gilson | F110120 | |
Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
Skim milk | HiMedia | M530 | |
Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
Tris base | HiMedia | TC072 | |
Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
Water bath | GRANT | JBN-18 | |
Xba1 | NEB | R0145S |