Le protocole décrit une méthode permettant d’introduire une diversité génétique contrôlable dans le génome du virus de l’hépatite C en combinant la synthèse d’ARN mutant sur toute la longueur à l’aide de la PCR sujette aux erreurs et de la génétique inverse. La méthode fournit un modèle pour la sélection phénotypique et peut être utilisée pour les génomes de virus à ARN à sens positif de 10 kb de long.
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Article de méthode
La génétique inverse pour concevoir des variants du virus à ARN à sens positif
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’absence d’une méthode pratique pour la génération itérative de divers variants viraux pleine longueur a entravé l’étude de l’évolution dirigée dans les virus à ARN. En intégrant une PCR complète du génome de l’ARN sujette aux erreurs et une génétique inverse, une mutagénèse de substitution aléatoire à l’échelle du génome peut être induite. Nous avons développé une méthode utilisant cette technique pour synthétiser diverses banques afin d’identifier des mutants viraux avec des phénotypes d’intérêt. Cette méthode, appelée synthèse d’ARN mutant pleine longueur (FL-MRS), offre les avantages suivants : (i) la possibilité de créer une grande bibliothèque via une PCR très efficace en une seule étape sujette aux erreurs ; (ii) la capacité de créer des groupes de banques avec différents niveaux de diversité génétique en manipulant la fidélité de l’ADN polymérase ; (iii) la création d’un produit de PCR complet pouvant directement servir de modèle pour la synthèse d’ARN mutant ; et (iv) la capacité de créer de l’ARN qui peut être délivré dans les cellules hôtes en tant que pool d’entrée non sélectionné pour dépister les mutants viraux du phénotype souhaité. Nous avons constaté, à l’aide d’une approche de génétique inverse, que la FL-MRS est un outil fiable pour étudier l’évolution dirigée par le virus à tous les stades du cycle de vie de l’isolat JFH1 du virus de l’hépatite C. Cette technique semble être un outil inestimable pour utiliser l’évolution dirigée afin de comprendre l’adaptation, la réplication et le rôle des gènes viraux dans la pathogenèse et la résistance aux antiviraux chez les virus à ARN de sens positif.
Introduction
Le criblage génétique direct commence par un phénotype viral d’intérêt, puis, en séquençant son génome et en le comparant à celui de la souche d’origine, tente d’identifier la ou les mutations à l’origine de ce phénotype. En revanche, dans les criblages génétiques inversés, des mutations aléatoires sont introduites dans un gène cible, suivies d’un examen du ou des phénotypes résultants1. Pour l’approche de la génétique inverse, la mutagénèse in vitro est la technique la plus largement utilisée pour créer un pool de variants qui sont ensuite criblés pour les phénotypes d’intérêt. Divers outils génétiques ont été rapportés pour réaliser ....
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Protocole
REMARQUE : La souche JFH1 (WT) utilisée ici est un cadeau de Takaji Wakita, de l’Institut national des maladies infectieuses. La lignée cellulaire de l’hépatome humain, Huh7.5, était un cadeau de Charles Rice, de l’Université Rockefeller. Un schéma de la méthode est présenté à la figure 1.
1. Mutagénèse par substitution pangénomique de JFH1 à l’aide de la PCR sujette aux erreurs
- Pour réaliser l’ep-PCR, préparer le mélange maître pour quatre séries d’expériences avec les amorces J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTTGAAAACGACGGC-3' et J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACTACCACTCTC -3' (
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Résultats
Une pléthore de variants complets du VHC peuvent être générés et dépistés pour les phénotypes résistants aux médicaments d’intérêt en suivant les procédures décrites à la figure 1. Des banques de mutants du génome complet ont été synthétisées à l’aide de clonal-pJFH1 en quantités décroissantes (100-10 ng), comme le montre la figure 2. Les rendements moyens des produits ep-PCR (banques de mutants) variaient de 3,8 à 12,5 ng/μL. La figure 3
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Discussion
Dans cette étude, nous avons détaillé une procédure simple et rapide de FL-MRS qui intègre l’ep-PCR18 et la génétique inverse pour synthétiser des banques de génomes complets du VHC, qui peuvent ensuite être utilisées dans un système de culture cellulaire pour générer des variants compétents en réplication pour le criblage de phénotypes résistants aux médicaments. L’utilisation de l’ADN polymérase Taq basse fidélité est une condition préalable à l’ep-PCR qui permet l’incorporation de substitutions.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Le financement de cette étude (numéro de subvention BT/PR10906/MED/29/860/2014) a été fourni par le Département de biotechnologie du gouvernement de l’Inde.
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Matériaux
2
Tar 460091 son3120000909F110120 d’analyse statistique Thermo 10966034
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1 kb plus l’échelle de l’ADN ; | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1,5 ml tube à centrifuger | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml tube à centrifuger | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm plat de culture cellulaire ; | Tarsons | 960010 | |
| Tube à centrifuger 50 ml | Tarsons | 546041 | |
| Acide acétique | Merck | A6283 | |
| Agarose ; | HiMedia | MB080 | |
| Unité d’électrophorèse sur gel Agrose | BioRad | 1704406 | |
| Armoire de biosécurité, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Albumine sérique bovine | HiMedia | MB083 | |
| Centrifugeuse ; | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Système de détection PCR en temps réel | BioRad | 1855201 | |
| Plaques de clonage 90 mm ; | Incubateur | ||
| ; | Spectromètre microvolume New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB ; Substrat ; Kit ; | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Ensemble de solutions de désoxynucléotide (dNTP) | NEB | N0446 | |
| Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) ; | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA sel tétrasodique dihydraté | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Sérum fœtal bovin ; | Gibco | 26140079 | |
| Formaldéhyde ; | Fishser Scientific | 12755 | |
| Système de documentation sur gel | ALPHA IMAGER | ||
| Anticorps secondaire anti-souris IgG (H+L) de chèvre, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Peroxyde d’hydrogène 30 % | Merck | 107209 | |
| Microscope inversé Nickon | ·nbsp ; ECLIPSE Ts2 | ||
| LB bouillon ; | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 ; | Thermo Fisher | 116680270 | réactif de transfection |
| Set de pipettes mécaniques | Eppendorf ; ; | ||
| Méthanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 & micro ; l ; | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 & micro ; l ; | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 & micro ; l ; | Tarsons | 521020 | |
| Tampon MOPS ; | GeNei | 3601805001730 | |
| Acides aminés non essentiels (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chimiquement compétent ;E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5&alpha ; |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| tubes PCR 0,2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycine ; | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector ADN |
| Tampon phosphate salin (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion ; Haute-fidélité ADN polymérase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Contrôleur de pipettes ; | Gilson ; | ||
| Platinum Taq ADN polymérase ; | Logiciel | ||
| Prism | GraphPad | ||
| QIAamp Viral RNA Mini kit ; | Qiagen | 52904 | kit d’isolement viral |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | kit de purification de cokum |
| RNeasy Mini Kit ; | QIAGEN | 74104 | Kit de nettoyage de l’ARN |
| Pipettes sérologiques 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Pipettes sérologiques 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Pipettes sérologiques10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Marqueur d’ARN simple brin 0,2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Lait écrémé ; | HiMedia | M530 | |
| Azoture de sodium 0,1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Transcriptase inverse ; | Invitrogen | 18080044 | transcriptase inverse |
| T100 Thermocycleur | BioRad | 1861096 | |
| T175 flacon de culture cellulaire ; | Tarsons | 159910 | |
| Fiole de culture cellulaire T25 ; | Tarsons | 950040 | |
| T7 Système de production d’ARN à grande échelle RiboMax Express ; | Promega | P1320 | ° ; Système de production d’ARN à grande échelle ; |
| Fiole de culture cellulaire T75 ; | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA polymérase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan ARN-to-CT ; 1-Étape ; Kit | Thermo Fisher | 4392653 | kit professionnel qRT-PCR ; |
| TOPO-XL--2 Kit complet de clonage PCR | Thermo Fisher | K8050-10 | kit pour le clonage de produits à PCR longue. |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsine-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Concentrateur sous vide ; | Eppendorf, Concentrateur Plus | 100248 | |
| Bain-marie ; | SUBVENTION | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
Références
- Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of ....
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Réimpressions et autorisations
