Omvendt genetik til at konstruere RNA-virusvarianter med positiv sans

Summary

Protokollen beskriver en metode til at indføre kontrollerbar genetisk mangfoldighed i hepatitis C-virusgenomet ved at kombinere mutant RNA-syntese i fuld længde ved hjælp af fejlbehæftet PCR og omvendt genetik. Metoden giver en model for fænotypeselektion og kan bruges til 10 kb lange RNA-virusgenomer med positiv sans.

Abstract

Manglen på en bekvem metode til iterativ generering af forskellige virale varianter i fuld længde har hindret undersøgelsen af rettet evolution i RNA-vira. Ved at integrere en fuld RNA-genomfejlbehæftet PCR og omvendt genetik kan tilfældig genom-dækkende substitutionsmutagenese induceres. Vi har udviklet en metode, der bruger denne teknik til at syntetisere forskellige biblioteker for at identificere virale mutanter med fænotyper af interesse. Denne metode, kaldet fuld længde mutant RNA-syntese (FL-MRS), giver følgende fordele: (i) evnen til at oprette et stort bibliotek via en meget effektiv et-trins fejlbehæftet PCR; ii) evnen til at skabe grupper af biblioteker med forskellige niveauer af genetisk mangfoldighed ved at manipulere troskaben af DNA-polymerase iii) oprettelse af et PCR-produkt i fuld længde, der direkte kan tjene som skabelon for mutant RNA-syntese og (iv) evnen til at skabe RNA, der kan leveres til værtsceller som en ikke-valgt inputpulje til screening for virale mutanter af den ønskede fænotype. Vi har ved hjælp af en omvendt genetisk tilgang fundet, at FL-MRS er et pålideligt værktøj til at studere viral-rettet evolution på alle stadier i livscyklussen for hepatitis C-virus, JFH1-isolat. Denne teknik ser ud til at være et uvurderligt værktøj til at anvende rettet evolution til at forstå tilpasning, replikation og rollen som virale gener i patogenese og antiviral resistens i RNA-vira med positiv sans.

Introduction

Fremadrettet genetisk screening begynder med en viral fænotype af interesse og forsøger derefter ved at sekventere sit genom og sammenligne det med den oprindelige stamme at identificere mutationen (e), der forårsager fænotypen. I modsætning hertil introduceres tilfældige mutationer i et målgen i omvendt genetisk screening efterfulgt af en undersøgelse af den resulterende fænotype(r)¹. For den omvendte genetiske tilgang er in vitro-mutagenese den mest anvendte teknik til at skabe en pulje af varianter, der efterfølgende screenes for fænotyper af interesse. Forskellige genetiske værktøjer er blevet rapporteret til opnåelse af genom-dækkende tilfældig mutagenese af RNA-vira, herunder fejlbehæftet PCR (ep-PCR)^2,3, cirkulær polymeraseforlængelse⁴ og Mu-transposonindsættelsesmutagenese 5,6,7. De to sidstnævnte metoder giver biblioteker med begrænset sekvensdiversitet og er tilbøjelige til at indføre store indsættelser og sletninger, som er meget dødelige for vira og alvorligt begrænser genopretningen af infektiøse virale varianter.

ep-PCR er en velkendt kraftfuld mutageneseteknik, der i vid udstrækning anvendes inden for proteinteknologi til at generere mutante enzymer til udvælgelse af fænotyper med ønskede egenskaber, såsom forbedret termisk stabilitet, substratspecificitet og katalytisk aktivitet ^8,9,10. Denne teknik er let at udføre, fordi den kræver simpelt udstyr, ikke involverer kedelige manipulationer, bruger kommercielt tilgængelige reagenser og er hurtig; Desuden genererer det biblioteker af høj kvalitet.

Her udviklede vi en ny metode til fuld længde mutant RNA-syntese (FL-MRS) til at generere komplette genomer af hepatitis C-virus (HCV) ved at integrere ep-PCR, som inducerer tilfældig genom-dækkende substitutionsmutagenese og omvendt genetik. Selv en enkelt nukleotidindsættelse eller deletion er meget skadelig for RNA-vira med positiv sans ([+]ssRNA); PCR-baseret substitutionsmutagenese er derfor den foretrukne metode til iterativ generering af store, forskelligartede biblioteker af fulde (+)ss RNA-virusgenomer med god levedygtighed.

FL-MRS er en ligetil tilgang, der kan anvendes på enhver RNA-virus med positiv sans med en ~ 10 kb genomlængde gennem det omhyggelige design af et primersæt, der binder til den virale cDNA-klon. pJFH1 er en infektiøs cDNA-klon, der koder for HCV-genotype 2a og kan rekapitulere alle trin i viruslivscyklussen. Ved at bruge FL-MRS-tilgangen demonstrerede vi syntesen af tilfældigt mutageniserede fuldgenombiblioteker (mutantbiblioteker [ML’er]) for at producere replikationskompetente JFH1-varianter, for hvilke der ikke var forudgående kendskab til egenskaberne forbundet med mutationer. Ved eksponering for et antiviralt middel overvandt nogle af de virale varianter hurtigt lægemiddeltrykket med den ønskede fænotypiske ændring. Ved hjælp af protokollen beskrevet her kan der genereres en overflod af virale varianter, hvilket skaber muligheder for at studere udviklingen af (+) ssRNA-vira.

Protocol

BEMÆRK: JFH1-stammen (WT), der blev brugt her, var en venlig gave fra Takaji Wakita, National Institute of Infectious Diseases. Den menneskelige hepatomcellelinje, Huh7.5, var en venlig gave fra Charles Rice, The Rockefeller University. Et skema over metoden er vist i figur 1. 1. Substitutionsmutagenese af JFH1 for hele genomet ved anvendelse af fejlbehæftet PCR For at udføre ep-PCR skal du forberede masterblandingen til fire sæt eks…

Representative Results

En overflod af HCV-varianter i fuld længde kan genereres og screenes for lægemiddelresistente fænotyper af interesse ved at følge procedurerne beskrevet i figur 1. Fuldgenommutantbiblioteker blev syntetiseret ved hjælp af klonal-pJFH1 i faldende mængder (100-10 ng), som vist i figur 2. Det gennemsnitlige udbytte af ep-PCR-produkter (mutantbiblioteker) varierede fra 3,8-12,5 ng/μL. Figur 3 viser de virale transkripter syntetis…

Discussion

I denne undersøgelse har vi beskrevet en enkel og hurtig FL-MRS-procedure, der integrerer ep-PCR¹⁸ og omvendt genetik til syntetisering af HCV-fuldgenombiblioteker, som derefter kan bruges i et cellekultursystem til at generere replikationskompetente varianter til screening af lægemiddelresistente fænotyper. Anvendelsen af Taq DNA-polymerase med lav nøjagtighed er en forudsætning for ep-PCR, der tillader inkorporering af substitutioner under PCR-amplifikation af et viralt genom i fuld længde…

Materials

1 kb plus DNA ladder	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml centrifuge tube	Tarsons	500010
15 ml centrifuge tube	Tarsons	546021
35 mm cell culture dish	Tarsons	960010
50 ml centrifuge tube	Tarsons	546041
Acetic acid	Merck	A6283
Agarose	HiMedia	MB080
Agrose gel electrophoresis unit	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
Bovine serum albumin	HiMedia	MB083
Centrifuge	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Cloning plates 90 mm	Tarson	460091
CO2 Incubator	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer	Titertek-Berthold	11050140
DAB Substrate Kit	Abcam	ab94665
dATP Solution	NEB	N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	NEB	N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)	SRL chemical	46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM high glucose	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate	HiMedia	GRM4918
Ethidium Bromide	Amresco	X328
Fetal bovine serum	Gibco	26140079
Formaldehyde	Fishser Scientific	12755
Gel Documentation System	ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Fisher	A16066
Hydrogen peroxide 30%	Merck	107209
Inverted microscope	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB broth	HiMedia	M1245
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	116680270	transfection reagent
Mechanical Pipette Set	Eppendorf	3120000909
Methanol	Merck	106009
Micro Tips 0.2-10 µl	Tarsons	521000
Micro Tips 10 – 100 µl	Tarsons	521010
Micro Tips 200-1000 µl	Tarsons	521020
MOPS buffer	GeNei	3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomycin	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
Pipette controller	Gilson	F110120
Platinum Taq DNA Polymerase	Thermo	10966034
Prism	GraphPad		statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit	Qiagen	52904	viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104	cokum purification kit
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Serological Pipettes10 ml	Thermo Fisher	170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb	Merck	R7020
Skim milk	HiMedia	M530
Sodium azide 0.1 M solution	Merck	8591
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080044	reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 cell culture flask	Tarsons	159910
T25 cell culture flask	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320	Large Scale RNA Production System
T75 cell culture flask	Tarsons	950050
Taq DNA Polymerase	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Thermo Fisher	4392653	commercial qRT-PCR kit
TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K8050-10	kit for cloning of long-PCR product
Tris base	HiMedia	TC072
Trypsin-EDTA solution	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Vacuum Concentrator	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
Water bath	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S