Omgekeerde genetica om varianten van het RNA-virus met positieve zin te ontwikkelen
Summary
Het protocol beschrijft een methode voor het introduceren van controleerbare genetische diversiteit in het genoom van het hepatitis C-virus door de synthese van mutant RNA over de volledige lengte te combineren met behulp van foutgevoelige PCR en omgekeerde genetica. De methode biedt een model voor fenotypeselectie en kan worden gebruikt voor 10 kb lange positive-sense RNA-virusgenomen.
Abstract
Het ontbreken van een handige methode voor het iteratief genereren van diverse virale varianten van volledige lengte heeft de studie van gerichte evolutie in RNA-virussen belemmerd. Door een volledig RNA-genoomfoutgevoelige PCR en omgekeerde genetica te integreren, kan willekeurige genoombrede substitutiemutagenese worden geïnduceerd. We hebben een methode ontwikkeld met behulp van deze techniek om verschillende bibliotheken te synthetiseren om virale mutanten met interessante fenotypes te identificeren. Deze methode, die mutante RNA-synthese van volledige lengte (FL-MRS) wordt genoemd, biedt de volgende voordelen: (i) de mogelijkheid om een grote bibliotheek te creëren via een zeer efficiënte foutgevoelige PCR in één stap; (ii) het vermogen om groepen bibliotheken met verschillende niveaus van genetische diversiteit te creëren door de getrouwheid van DNA-polymerase te manipuleren; (iii) de creatie van een PCR-product van volledige lengte dat rechtstreeks kan dienen als sjabloon voor de synthese van mutant RNA; en (iv) het vermogen om RNA te creëren dat in gastheercellen kan worden afgeleverd als een niet-geselecteerde invoerpool om te screenen op virale mutanten van het gewenste fenotype. We hebben ontdekt, met behulp van een omgekeerde genetische benadering, dat FL-MRS een betrouwbaar hulpmiddel is om viraal gerichte evolutie te bestuderen in alle stadia van de levenscyclus van het hepatitis C-virus, JFH1-isolaat. Deze techniek lijkt een hulpmiddel van onschatbare waarde te zijn om gerichte evolutie te gebruiken om aanpassing, replicatie en de rol van virale genen in pathogenese en antivirale resistentie in positief-sense RNA-virussen te begrijpen.
Introduction
Voorwaartse genetische screening begint met een viraal fenotype dat van belang is en probeert vervolgens, door het genoom te sequencen en te vergelijken met dat van de oorspronkelijke stam, de mutatie(s) te identificeren die dat fenotype veroorzaken. Bij omgekeerde genetische screenings daarentegen worden willekeurige mutaties geïntroduceerd in een doelgen, gevolgd door een onderzoek van het (de) resulterende fenotype(n)1. Voor de omgekeerde genetica-benadering is in-vitromutagenese de meest gebruikte techniek om een pool van varianten te creëren die vervolgens worden gescreend op interessante fenotypes. Er zijn verschillende genetische hulpmiddelen gerapporteerd voor het bereiken van genoombrede willekeurige mutagenese van RNA-virussen, waaronder foutgevoelige PCR (ep-PCR)2,3, circulaire polymerase-extensie4 en Mu-transposon-insertiemutagenese 5,6,7. De laatste twee methoden leveren bibliotheken op met een beperkte sequentiediversiteit en zijn vatbaar voor de introductie van grote inserties en deleties, die zeer dodelijk zijn voor virussen en het herstel van infectieuze virale varianten ernstig beperken.
ep-PCR is een bekende krachtige mutagenesetechniek die veel wordt gebruikt in eiwitengineering om mutante enzymen te genereren voor de selectie van fenotypes met gewenste eigenschappen, zoals verbeterde thermische stabiliteit, substraatspecificiteit en katalytische activiteit 8,9,10. Deze techniek is gemakkelijk uit te voeren omdat er eenvoudige apparatuur voor nodig is, er geen vervelende manipulaties bij betrokken zijn, in de handel verkrijgbare reagentia worden gebruikt en het snel is; Bovendien genereert het bibliotheken van hoge kwaliteit.
Hier ontwikkelden we een nieuwe methode voor mutante RNA-synthese van volledige lengte (FL-MRS) om volledige genomen van het hepatitis C-virus (HCV) te genereren door ep-PCR te integreren, wat willekeurige genoombrede substitutiemutagenese en omgekeerde genetica induceert. Zelfs een enkele nucleotide-insertie of -deletie is zeer schadelijk voor positief-sense RNA-virussen ([+]ssRNA); daarom is op PCR gebaseerde substitutiemutagenese de voorkeursmethode voor het iteratief genereren van grote, diverse bibliotheken van volledige (+)ss RNA-virusgenomen met een goede levensvatbaarheid.
FL-MRS is een eenvoudige benadering die kan worden toegepast op elk positief-sense RNA-virus met een genoomlengte van ~10 kb door het nauwgezette ontwerp van een primerset die zich bindt aan de virale cDNA-kloon. pJFH1 is een infectieuze cDNA-kloon die codeert voor HCV-genotype 2a en alle stappen van de levenscyclus van het virus kan recapituleren. Door gebruik te maken van de FL-MRS-benadering hebben we de synthese aangetoond van willekeurig gemutageniseerde full-genome bibliotheken (mutant libraries [ML’s]) om replicatie-competente JFH1-varianten te produceren waarvoor er geen voorkennis was van de eigenschappen geassocieerd met mutaties. Bij blootstelling aan een antiviraal middel overwonnen sommige van de virale varianten snel de medicijndruk met de gewenste fenotypische verandering. Met behulp van het hier beschreven protocol kan een overvloed aan virale varianten worden gegenereerd, waardoor mogelijkheden ontstaan om de evolutie van (+)ssRNA-virussen te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie hebben we een eenvoudige en snelle FL-MRS-procedure beschreven die ep-PCR18 en omgekeerde genetica integreert voor het synthetiseren van HCV-bibliotheken met volledig genoom, die vervolgens kunnen worden gebruikt in een celkweeksysteem om replicatiecompetente varianten te genereren voor de screening van resistente fenotypes. Het gebruik van low-fidelity Taq-DNA-polymerase is een voorwaarde voor ep-PCR die de opname van substituties mogelijk maakt tijdens PCR-amplificatie van een vir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financieringssteun (subsidienummer BT/PR10906/MED/29/860/2014) voor deze studie werd verstrekt door het Department of Biotechnology, Government of India.
Materials
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -. J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
