Genética inversa para diseñar variantes de virus de ARN de sentido positivo
Summary
El protocolo describe un método para introducir una diversidad genética controlable en el genoma del virus de la hepatitis C mediante la combinación de la síntesis de ARN mutante de longitud completa mediante PCR propensa a errores y genética inversa. El método proporciona un modelo para la selección del fenotipo y se puede utilizar para genomas de virus de ARN de sentido positivo de 10 kb de largo.
Abstract
La falta de un método conveniente para la generación iterativa de diversas variantes virales de longitud completa ha impedido el estudio de la evolución dirigida en los virus de ARN. Al integrar una PCR propensa a errores en el genoma de ARN completo y una genética inversa, se puede inducir la mutagénesis de sustitución aleatoria de todo el genoma. Hemos desarrollado un método que utiliza esta técnica para sintetizar diversas bibliotecas con el fin de identificar mutantes virales con fenotipos de interés. Este método, llamado síntesis de ARN mutante de longitud completa (FL-MRS), ofrece las siguientes ventajas: (i) la capacidad de crear una gran biblioteca a través de una PCR altamente eficiente y propensa a errores en un solo paso; (ii) la capacidad de crear grupos de bibliotecas con diferentes niveles de diversidad genética mediante la manipulación de la fidelidad de la ADN polimerasa; iii) la creación de un producto de PCR de longitud completa que pueda servir directamente como molde para la síntesis de ARN mutante; y (iv) la capacidad de crear ARN que se puede entregar a las células huésped como un grupo de entrada no seleccionado para detectar mutantes virales del fenotipo deseado. Hemos encontrado, utilizando un enfoque de genética inversa, que FL-MRS es una herramienta confiable para estudiar la evolución dirigida al virus en todas las etapas del ciclo de vida del virus de la hepatitis C, aislado de JFH1. Esta técnica parece ser una herramienta invaluable para emplear la evolución dirigida para comprender la adaptación, la replicación y el papel de los genes virales en la patogénesis y la resistencia antiviral en los virus de ARN de sentido positivo.
Introduction
El cribado genético directo comienza con un fenotipo viral de interés y luego, a través de la secuenciación de su genoma y su comparación con el de la cepa original, intenta identificar la(s) mutación(es) causante(s) de ese fenotipo. Por el contrario, en los cribados genéticos inversos, se introducen mutaciones aleatorias en un gen diana, seguidas de un examen del fenotipo o fenotipos resultantes1. Para el enfoque de genética inversa, la mutagénesis in vitro es la técnica más utilizada para crear un conjunto de variantes que posteriormente se examinan en busca de fenotipos de interés. Se han descrito varias herramientas genéticas para lograr la mutagénesis aleatoria de virus de ARN en todo el genoma, incluida la PCR propensa a errores (ep-PCR)2,3, la extensión circular de la polimerasa4 y la mutagénesis de inserción de transposones Mu 5,6,7. Los dos últimos métodos producen bibliotecas que albergan una diversidad de secuencias limitada y son propensas a la introducción de grandes inserciones y deleciones, que son altamente letales para los virus y limitan gravemente la recuperación de variantes virales infecciosas.
La ep-PCR es una conocida y potente técnica de mutagénesis ampliamente utilizada en ingeniería de proteínas para generar enzimas mutantes para la selección de fenotipos con propiedades deseadas, como una mayor estabilidad térmica, especificidad del sustrato y actividad catalítica 8,9,10. Esta técnica es fácil de realizar porque requiere un equipo sencillo, no implica manipulaciones tediosas, utiliza reactivos disponibles en el mercado y es rápida; Además, genera bibliotecas de alta calidad.
Aquí, desarrollamos un método novedoso para la síntesis de ARN mutante de longitud completa (FL-MRS) para generar genomas completos del virus de la hepatitis C (VHC) mediante la integración de ep-PCR, que induce mutagénesis de sustitución aleatoria de todo el genoma y genética inversa. Incluso la inserción o deleción de un solo nucleótido es altamente perjudicial para los virus de ARN de sentido positivo ([+]ssRNA); por lo tanto, la mutagénesis de sustitución basada en PCR es el método preferido para la generación iterativa de bibliotecas grandes y diversas de genomas completos de virus de ARN (+)ss con buena viabilidad.
FL-MRS es un enfoque sencillo que se puede aplicar a cualquier virus de ARN de sentido positivo con una longitud de genoma de ~ 10 kb a través del diseño meticuloso de un conjunto de cebadores que se une al clon viral de ADNc. pJFH1 es un clon infeccioso de ADNc que codifica el genotipo 2a del VHC y puede recapitular todos los pasos del ciclo de vida del virus. Mediante el uso del enfoque FL-MRS, demostramos la síntesis de bibliotecas de genoma completo mutagenizadas aleatoriamente (bibliotecas de mutantes [ML]) para producir variantes de JFH1 competentes para la replicación para las que no había conocimiento previo de las propiedades asociadas con las mutaciones. Tras la exposición a un antiviral, algunas de las variantes virales superaron rápidamente la presión del fármaco con el cambio fenotípico deseado. Utilizando el protocolo descrito aquí, se puede generar una gran cantidad de variantes virales, creando oportunidades para estudiar la evolución de los virus (+)ssRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, hemos detallado un procedimiento simple y rápido de FL-MRS que integra ep-PCR18 y genética inversa para sintetizar bibliotecas de genoma completo del VHC, que luego se pueden usar en un sistema de cultivo celular para generar variantes competentes para la replicación para el cribado de fenotipos resistentes a los medicamentos. El uso de la ADN polimerasa Taq de baja fidelidad es un requisito previo de la ep-PCR que permite la incorporación de sustituciones durante la amplifica…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El apoyo financiero (número de subvención BT/PR10906/MED/29/860/2014) para este estudio fue proporcionado por el Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India.
Materials
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
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