Vurdering av mitokondriefunksjon i isjiasnerven ved høyoppløselig respirometri
Summary
Høyoppløselig respirometri koblet til fluorescenssensorer bestemmer mitokondrie oksygenforbruk og reaktiv oksygenart (ROS) generasjon. Den nåværende protokollen beskriver en teknikk for å vurdere mitokondrie respiratoriske rater og ROS-produksjon i permeabilisert isjiasnerve.
Abstract
Mitokondrie dysfunksjon i perifere nerver følger med flere sykdommer forbundet med perifer nevropati, som kan utløses av flere årsaker, inkludert autoimmune sykdommer, diabetes, infeksjoner, arvelige lidelser og svulster. Vurdering av mitokondriefunksjon i mus perifere nerver kan være utfordrende på grunn av den lille prøvestørrelsen, et begrenset antall mitokondrier tilstede i vevet, og tilstedeværelsen av en myelinhylse. Teknikken beskrevet i dette arbeidet minimerer disse utfordringene ved å bruke en unik permeabiliseringsprotokoll tilpasset en som brukes til muskelfibre, for å vurdere isjiasnerve mitokondriefunksjon i stedet for å isolere mitokondriene fra vevet. Ved å måle fluorimetrisk reaktiv artsproduksjon med Amplex Red/Peroxidase og sammenligne forskjellige mitokondrie-substrater og hemmere i saponin-permeabiliserte nerver, var det mulig å oppdage mitokondrie-respiratoriske tilstander, reaktive oksygenarter (ROS) og aktiviteten til mitokondriekomplekser samtidig. Derfor gir metoden som presenteres her fordeler sammenlignet med vurderingen av mitokondriefunksjon ved andre teknikker.
Introduction
Mitokondrier er avgjørende for å opprettholde celle levedyktighet og utføre mange cellefunksjoner som energimetabolisme (glukose, aminosyre, lipid og nukleotid metabolisme veier). Som det primære stedet for reaktiv oksygenarter (ROS) produksjon, er mitokondrier sentrale i flere cellesignaleringsprosesser som apoptose og deltar i syntesen av jern-svovel (Fe-S) klynger, mitokondrieprotein import og modning, og vedlikehold av deres genom og ribosomer 1,2,3. Det mitokondriemembrandynamikknettverket styres av fusjons- og fisjonsprosesser, og de har også maskiner for kvalitetskontroll og mitophagy 4,5,6.
Mitokondrie dysfunksjon er forbundet med utseendet av flere patologiske tilstander som kreft, diabetes og fedme7. Forstyrrelser i mitokondriefunksjonen oppdages i nevrodegenerative lidelser som påvirker sentralnervesystemet, som ved Alzheimers sykdom 8,9, Parkinsons sykdom 10,11, amyotrofisk lateral sklerose12,13 og Huntington sykdom14,15 . I det perifere nervesystemet observeres tap av mitokondriefunksjon i axoner i immun nevropatier, som Guillain-Barré syndrom16,17, og i forbindelse med høy mitokondrie ROS-produksjon i axoner, fører disse hendelsene til MAP Kinase-aktivering i Schwann-cellene18. Dette viser at mitokondriefysiologi kan være viktig, ikke bare for en stedsspesifikk celle, men for et helt vev. I HIV-assosiert distal sensorisk polyneuropati (HIV-DSP) har mitokondrier en rolle i mekanismen der transaktivatoren for transkripsjon (HIV-TAT) protein gjør det mulig for HIV å replikere effektivt, samt flere andre roller i HIV-infeksjonspatogenese19,20.
Evaluering av isjias nerve mitokondrie fysiologi har dukket opp som et viktig mål for å undersøke nevropati 7,21,22. I diabetisk nevropati tyder proteomiske og metabolomiske analyser på at de fleste molekylære endringer i diabetes påvirker isjiasnerven mitokondrie oksidativ fosforylering og lipidmetabolisme7. Disse endringene synes også å være tidlige tegn på fedme-indusert diabetes21. I en musemodell av kjemoterapiindusert smertefull nevropati oppdages mitokondriehemming i isjiasnerven som en reduksjon i oksidativ fosforylering22, og en reduksjon av mitokondriekomplekser aktiviteter, membranpotensial og ATP-innhold23. Men selv om flere grupper har sitert mitokondriedysfunksjon i nevropatier, er disse studiene begrenset til målinger av aktivitet i mitokondriekomplekser uten bevaring av mitokondriemembranene, uten evaluering av mitokondrieintegritet eller målinger av ATP-innhold som en parameter for mitokondrie-ATP-produksjon. Generelt krever en riktig vurdering av mitokondrie oksygenforbruk og ROS-produksjon isolering av mitokondrier ved differensial sentrifugering i en percoll / sukrose gradient. Isolering av mitokondrier kan også være en begrensende faktor for isjiasnervevev på grunn av den store mengden vev som trengs og mitokondrier tap og forstyrrelser.
Den nåværende studien tar sikte på å gi en protokoll for å måle mitokondriefysiologi som mitokondrie oksygenforbruk og ROS-produksjon i isjiasnerven, bevare mitokondriemembraner og uten behov for å isolere mitokondrier. Denne protokollen er tilpasset fra oksygenforbruksmålinger i permeabiliserte muskelfibre24 ved høyoppløselig respirometri (HRR). Fordelene ved denne prosedyren er muligheten for å evaluere mitokondrier i små mengder vev som isjiasnerven og evaluere mitokondrieparametere in situ, og dermed bevare mitokondriemiljøet, strukturen og bioenergetisk profil, for å oppnå et fysiologisk pålitelig resultat. Mitokondrie-luftveiene ble bestemt med substrater og hemmere etter isjiasnervens permeabilisering for å vurdere mitokondriebioenergetikk og cytokrom c koeffisient for mitokondriemembranintegritet på riktig måte, og gir en guide for trinn i mitokondrie-elektrontransportsystemet (ETS) evaluering og beregning av essensielle parametere. Denne studien kan gi verktøy for å svare på spørsmål i patofysiologiske mekanismer der isjias nervemetabolisme er implisert, for eksempel perifere nevropatier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere sykdommer eller tilstander som følger med nevropatier har mitokondrie dysfunksjon som en risikofaktor. Evalueringen av mitokondriefunksjon i perifere nerver er avgjørende for å belyse hvordan mitokondriene virker under disse nevrodegenerative forholdene. Vurderingen av mitokondriefunksjon er arbeidskrevende på grunn av vanskeligheten med isolasjonsmetoden og knappheten på materialet. Dermed er utviklingen av vevspermeabiliseringsteknikker som ikke krever isolering av mitokondrier viktig.
<p class="jove_con…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble finansiert av Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Vi er takknemlige til Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli og Dr. Claudio Masuda for støtten med laboratoriefasiliteter, og Dr. Martha Sorenson for snille og verdifulle kommentarer for å forbedre artikkelen.
Materials
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Génétique. 207 (3), 843-871 (2017).
- Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
- Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
- Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
- Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
- Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson’s disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
- Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
- Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
- Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
- Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
- Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and ‘plugging’ of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
- Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
- Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
- Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
- Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, (2019).
- Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
- Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
- Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
- Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , 80 (2014).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
- Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
- Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
- Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
- Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
- Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
- Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
- Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
- Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
- Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).
