In situ Hybridisering kombineret med immunhistokemi i kryosektionerede zebrafiskembryoner
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man opnår billeder ved at kombinere in situ hybridisering og immunhistokemi af zebrafiskens embryonale sektioner. In situ hybridisering blev udført før kryosektion, efterfulgt af antistoffarvning. Det er nyttigt at detektere ekspressionsmønstre af to gener i zebrafisk, hvis der er mangel på antistoffer.
Abstract
Som hvirveldyr har zebrafisken været meget udbredt i biologiske undersøgelser. Zebrafisk og mennesker deler høj genetisk homologi, hvilket gør det muligt at bruge det som model for menneskelige sygdomme. Genfunktionsundersøgelse er baseret på påvisning af genekspressionsmønstre. Selvom immunhistokemi tilbyder en effektiv måde at analysere proteinekspression på, begrænser det begrænsede antal kommercielt tilgængelige antistoffer i zebrafisk anvendelsen af costaining. In situ hybridisering anvendes i vid udstrækning i zebrafiskembryoner til at detektere mRNA-ekspression. Denne protokol beskriver, hvordan man opnår billeder ved at kombinere in situ hybridisering og immunhistokemi for zebrafiskembryosektioner. In situ hybridisering blev udført før kryosektion, efterfulgt af antistoffarvning. Immunhistokemi og billeddannelse af en enkelt kryosektion blev udført efter in situ hybridisering. Protokollen er nyttig til at optrævle ekspressionsmønsteret for to gener, først ved in situ transkriptdetektion og derefter ved immunhistokemi mod et protein i samme afsnit.
Introduction
Zebrafisken er en stærk hvirveldyrmodel til studier af udvikling og genetik 1,2. Zebrafisk og mennesker deler høj genetisk homologi (70% af generne deles med det menneskelige genom), hvilket gør det muligt at bruge det som model for menneskelige sygdomme3. Hos zebrafisk er det ret almindeligt at detektere ekspressionsmønstre for to gener og deres rumlige forhold. Immunohistokemi blev først brugt i 1941 til at detektere patogener i inficerede væv ved at anvende FITC-mærkede antistoffer4. Målproteinet i vævssektionen mærkes først med et primært antistof, og sektionen mærkes derefter med et sekundært antistof mod det primære antistofs værtsart immunoglobulin. Antistoffarvning er en robust tilgang til at detektere lokalisering af proteiner, som tilbyder høj optisk opløsning på intracellulært niveau. Antallet af tilgængelige antistoffer er dog meget begrænset hos zebrafisk. En nylig undersøgelse viser, at ca. 112.000 antistoffer er kommercielt tilgængelige for mus; Imidlertid har meget få antistoffer vist sig at være pålidelige i zebrafisk5.
I stedet er in situ-hybridisering i zebrafisk blevet anvendt bredt til analyse af genekspressionsmønstre. Denne metode blev først brugt til at vurdere genekspression i Drosophila-embryoner i 1980’erne6,7, og siden da er denne teknologi løbende blevet udviklet og forbedret. Oprindeligt blev radioaktivt mærkede DNA-sonder brugt til at detektere mRNA-transkripter; Den rumlige opløsning var imidlertid relativt lav, og der var potentielle sundhedsrisici forårsaget af radioaktiviteten. Derefter er in situ-hybridisering afhængig af RNA-sonderne mærket med digoxigenin (DIG) eller fluorescein (Fluo), som konjugeres til alkalisk fosfatase (AP) eller detekteres ved fluorescerende tyramidsignalforstærkning (TSA)8,9. Selvom TSA er blevet brugt til at detektere to eller tre gener, er DIG-mærkning af RNA-sonder og antiDIG AP-konjugeret antistof stadig meget følsomme, stabile og udbredte tilgange til in situ-hybridisering. Derfor er kommercialiserede antistoffer kombineret med DIG-mærkede in situ-sonder nyttige til at give indsigt i proteinlokalisering og ekspression af et gen.
Helmonterede embryoner kan ikke afsløre det rumlige forhold mellem gener på grund af den lave optiske opløsning, selvom zebrafiskembryoner er små og gennemsigtige10. Derfor er sektionering nødvendig for at analysere ekspressionsmønstre af gener på intracellulært niveau. Kryosektionering har været meget udbredt i zebrafisk, da det er let at udføre og effektivt kan bevare antigenet. Derfor tilbyder in situ-hybridisering kombineret med immunhistokemi i zebrafiskkryosektioner en kraftfuld måde at analysere ekspressionsmønstre for to gener. En kombination af in situ hybridisering og immunhistokemi er blevet anvendt på zebrafisk11. Imidlertid blev proteinase K-behandling brugt til at forbedre sondepenetration på bekostning af antigenintegritet. For at overvinde denne begrænsning bruger denne protokol opvarmning til at inducere antigenhentning. Denne protokol gælder ikke kun for embryoner i forskellige stadier og vævssektioner af forskellig tykkelse (14 μm hovedsektioner og 20 μm rygmarvssektioner), men den er også blevet verificeret ved hjælp af gener udtrykt i to organer, herunder hoved og rygmarv.
Denne artikel vil beskrive, hvordan man kombinerer in situ hybridisering og antistoffarvning i zebrafiskembryoner i kryosektioner. Alsidigheden af denne protokol demonstreres ved anvendelse af en række in situ hybridiserings-immunohistokemiske kombinationer, herunder in situ hybridiseringssonder til to forskellige neuroner. Denne metode er egnet til påvisning af mRNA og protein i forskellige regioner og embryoner i forskellige aldre samt ekspressionsmønstre for to gener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol foreslår en kombination af in situ hybridisering og immunhistokemi, et vigtigt skridt i colokaliseringsforsøgene på zebrafiskembryoner. Denne metode fungerer som en nem og effektiv måde at samtidig analysere et mRNA og et protein. In situ hybridisering og antistoffarvning blev udført på zebrafiskembryoner. I modsætning til flere protokoller, der tidligere er offentliggjort14,15,16, blev immunofluores…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) og Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O’Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
