Génération de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation en lignée musculaire squelettique

Résumé

Nous décrivons un protocole pour l’isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu du cordon ombilical humain et leur différenciation dans la lignée musculaire squelettique.

Résumé

L’exploration du potentiel thérapeutique des cellules souches mésenchymateuses dépend de la facilité d’isolement, de la puissance vers la différenciation, ainsi que de la fiabilité et de la robustesse de la source. Nous décrivons ici un protocole par étapes pour l’isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu du cordon ombilical humain (cSM), leur immunophénotypage et la propagation de telles cultures sur plusieurs passages. Dans cette procédure, la viabilité des uMSC est élevée car il n’y a pas de digestion enzymatique. De plus, l’ablation des vaisseaux sanguins, y compris les artères du cordon ombilical et la veine, garantit qu’il n’y a pas de contamination des cellules d’origine endothéliale. En utilisant la cytométrie en flux, les cSEm lors de l’isolement sont CD45⁻CD34⁻, ce qui indique une absence de cellules de la lignée hématopoïétique. Il est important de noter qu’ils expriment les marqueurs de surface clés, CD105, CD90 et CD73. Lors de l’établissement des cultures, cet article décrit une méthode efficace pour induire la différenciation de ces uMSC dans la lignée musculaire squelettique. Une analyse détaillée de la progression myogénique dans les uMSC différenciés révèle que les uMSC expriment Pax7, un marqueur des progéniteurs myogéniques dans les premiers stades de différenciation, suivis de l’expression de MyoD et Myf5, et, enfin, d’un marqueur de différenciation terminal, la chaîne lourde de myosine (MyHC).

Introduction

Le cordon ombilical humain a été crédité de posséder un réservoir robuste de cellules souches mésenchymateuses, qui sont actuellement explorées pour les thérapies régénératives en raison de leurs taux de prolifération et de différenciation robustes, de leurs propriétés immunomodulatrices et de leur capacité à générer des cellules à partir des trois couches germinales¹. Le tissu du cordon ombilical se compose de plusieurs compartiments tels que le sang de cordon ombilical, le sous-endothélium de la veine ombilicale et la gelée de Wharton (WJ), qui englobe en soi trois régions indistinctes: la zone périvasculaire, la zone intervasculaire et le so....

Protocole

L’utilisation du tissu de cordon ombilical dans cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel pour la recherche sur les cellules souches (IC-SCR), le Comité d’éthique institutionnelle, l’Institut translationnel des sciences et de la technologie de la santé (IEC-THSTI), le Comité d’éthique institutionnelle de l’hôpital civil de Gurugram, Haryana, et le Comité institutionnel de biosécurité, THSTI. Des échantillons de tissu de cordon humain ont été prélevés lors d’accouchements à terme au moment de la naissance. Le consentement écrit éclairé a été obtenu des sujets. Toutes les méthodes ont été mises en œuvre conformément aux directives et réglementations perti....

Résultats

Le succès de l’isolement des cSUm du tissu du cordon ombilical est >95%, contrairement aux faibles taux de réussite du sang de cordon entier. Une fois l’isolement réussi des cSEm, l’analyse FACS révèle que toutes les cellules sont CD34⁻CD45⁻CD105⁺CD90⁺. Cependant, dans l’analyse comparative, les cSEm isolés du sang de cordon présentent des populations hétérogènes, dans lesquelles une proportion de cellules présentent CD34 ⁺ CD45 ⁺ CD105⁺ (~ 1.......

Discussion

Étapes critiques
Une étape critique de ce protocole est la collecte de tissus dans des conditions aseptiques, du moment de l’accouchement au maintien des cultures stériles, pendant toute la durée de la propagation. Lors de la collecte du cordon, il est essentiel que le cordon ne touche aucune surface non stérilisée et soit tamponné à l’extérieur avec de l’éthanol à 70% avant d’être collecté dans des tubes contenant du PBS complété par des antibiotiques. Il est important de limiter le temps entre la co.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Amphotéricine B	Sigma Aldrich	A2411
Solution antibiotique 100x Liquide, testé pour les endotoxines (10 000 U de pénicilline et 10 mg de streptomycine/mL dans une solution saline normale à 0,9 %)	HiMedia	A001A-50mL
Anticorps anti-GAPDH	Sigma Aldrich	G8795
Anticorps anti-MyHC (My32)	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
Anticorps anti-MyoD (5.8A)	Novus Biologicals	NB100-56511
Anticorps anti-myogénine (clone F5D)	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
Anticorps anti-Pax7	DSHB	DSHB-C1-576
APC Clone CD90 anti-humain 5E10	BD Biosciences	559869
Collagène de type 1	Merck	C8919
D (+) Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Dexaméthasone	SIGMA	D4902
FACSCanto II ou FACSAria III	BD Biosciences
Sérum fœtal bovin, qualifié Brésil	GIBCO	10270106	ne pas être inactivé thermiquement
FITC Souris anti-humaine Clone CD106 51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC Souris anti-humain CD14 clone M5E2	BD Biosciences	557153
FITC Souris anti-humain clone CD31 WM59	BD Biosciences	557508
FITC Souris anti-humain CD34 clone 581	BD Biosciences	555821
FITC Souris anti-humain CD45 clone HI30	BD Biosciences	555482
FITC Souris anti-humain CD49D clone 9F10	BD Biosciences	560840
FITC Souris anti-humaine CD90 clone 5E10	BD Biosciences	555595
FITC Souris anti-humaine HLA-A,B,C clone G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC Souris anti-humain IgG clone G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo software	BD Biosciences
Gentamicine	Sigma Aldrich	G1264
Sérum de cheval	HiMedia	RM1239
Hydrocortisone	Merck	H4001
Laminine	Merck	L2020
MEM Alpha Modification sans L-glutamine, ribo- et désoxyribonucléosides	Hyclone	SH30568. FS	Milieu basal pour uMSCs
PE Souris clone CD105 anti-humain 266	BD Biosciences	560839
PE Souris clone CD44 anti-humain 515	BD Biosciences	550989
PE Souris anti-humain CD49E clone llA1	BD Biosciences	555617
PE Souris clone IgG anti-humain G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7 Souris anti-humaine CD73 CLONE AD2	BD Biosciences	561258
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH = 7,4	HiMedia	M1866
Solution de trypsine/EDTA (1x 0,25 % de trypsine et 0,02 % d’EDTA dans une solution saline équilibrée Hanks (HBSS)	HiMedia	TCL049-100mL