ハイスループット極低温電子顕微鏡のための厚さ制御されたマイクロパターンチップの作製
Summary
酸化グラフェン窓を備えたマイクロパターンチップを新たに開発し、マイクロエレクトロメカニカルシステム技術を適用して製造し、さまざまな生体分子やナノ材料の効率的で高スループットな極低温電子顕微鏡イメージングを可能にします。
Abstract
極低温電子顕微鏡(cryo-EM)を用いた生体分子の効率的かつハイスループットな構造解析における主な制限は、ナノスケールで氷厚を制御したクライオEMサンプルを調製することの難しさです。シリコン(Si)ベースのチップは、厚さ制御された窒化シリコン(SixNy)膜上にパターン化された酸化グラフェン(GO)窓を有するマイクロホールの規則的な配列を有し、マイクロエレクトロメカニカルシステム(MEMS)技術を適用して開発された。UVフォトリソグラフィー、化学蒸着、薄膜のウェットエッチングおよびドライエッチング、および2Dナノシート材料のドロップキャスティングは、GO窓を有するマイクロパターンチップの量産に使用された。マイクロホールの深さは、クライオEM分析用の試料のサイズに応じて、必要に応じて氷の厚さを制御するために調整されます。生体分子に対するGOの良好な親和性は、クライオEMサンプル調製中に目的の生体分子をマイクロホール内に集中させます。GOウィンドウを備えたマイクロパターンチップは、さまざまな生体分子や無機ナノ材料のハイスループットクライオEMイメージングを可能にします。
Introduction
極低温電子顕微鏡(cryo-EM)は、タンパク質の3次元(3D)構造を天然状態に分解するために開発されました1、2、3、4。この技術は、ガラス質氷の薄層(10〜100nm)にタンパク質を固定し、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用してランダムに配向したタンパク質の投影画像を取得し、サンプルを液体窒素温度に維持することを含む。数千から数百万の投影画像が取得され、計算アルゴリズムによってタンパク質の3D構造を再構築するために使用される5,6。クライオEMによる分析を成功させるために、ブロッティング条件、湿度、温度を制御する装置をプランジフリーズすることにより、クライオサンプル調製が自動化されています。試料溶液を穴状の炭素膜を有するTEMグリッド上にロードし、連続的にブロットして余分な溶液を除去し、次いで液体エタンでプランジ凍結して薄いガラス質氷を生成する1,5,6。クライオEMの進歩とサンプル調製7の自動化に伴い、クライオEMは、ウイルスのエンベロープタンパク質や細胞膜のイオンチャネルタンパク質などのタンパク質の構造を解決するためにますます使用されています8、9、10。病原性ウイルス粒子のエンベロープタンパク質の構造は、ウイルス感染の病態を理解し、COVID-19パンデミックを引き起こしたSARS-CoV-2 11などの診断システムとワクチンを開発するために重要です。また、クライオEM技術は、電池12,13,14や触媒系14,15に用いられる光感応性材料のイメージングや、溶液状態の無機材料の構造解析16など、近年材料科学にも応用されている。
クライオEMおよび関連技術の著しい発展にもかかわらず、クライオサンプル調製には限界があり、ハイスループット3D構造解析の妨げとなっています。最適な厚さの硝子体氷膜を作製することは、原子分解能を有する生物材料の3D構造を得るために特に重要である。氷は、氷によって散乱された電子からのバックグラウンドノイズを最小限に抑え、電子ビーム経路1,17に沿った生体分子の重なりを禁止するのに十分なほど薄くなければならない。しかし、氷が薄すぎると、タンパク質分子が好ましい向きで整列したり、変性したりする可能性があります18、19、20。したがって、ガラス質氷の厚さは、目的の材料のサイズに応じて最適化する必要があります。さらに、サンプル調製と、調製されたTEMグリッド上の氷およびタンパク質の完全性の手動スクリーニングには、通常、広範な努力が必要です。このプロセスは非常に時間がかかり、ハイスループットな3D構造解析の効率を妨げます。したがって、クライオEMサンプル調製の信頼性と再現性の向上は、構造生物学および商業創薬、ならびに材料科学におけるクライオEMの利用を強化するであろう。
ここでは、氷の厚さを制御したハイスループットクライオEM用に設計された酸化グラフェン(GO)ウィンドウを備えたマイクロパターンチップを製造するための微細加工プロセスを紹介します21。マイクロパターン化されたチップは、イメージング目的に応じてチップの構造と寸法を操作できるマイクロエレクトロメカニカルシステム(MEMS)技術を使用して製造されました。GOウィンドウを備えたマイクロパターンチップは、サンプル溶液で充填できるマイクロウェル構造を有し、マイクロウェルの深さを調整してガラス質氷の厚さを制御することができる。生体分子に対するGOの強い親和性により、可視化のための生体分子の濃度が向上し、構造解析の効率が向上します。さらに、マイクロパターン化されたチップはSiフレームで構成されており、グリッド19に高い機械的安定性を提供し、サンプル調製手順およびクライオEMイメージング中のチップの取り扱いに最適です。したがって、MEMS技術によって作製されたGOウィンドウを備えたマイクロパターンチップは、クライオEMサンプル調製の信頼性と再現性を提供し、クライオEMに基づく効率的でハイスループットな構造解析を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、GOウィンドウを備えたマイクロパターンチップを製造するための微細加工プロセスを紹介します。作製されたマイクロパターンチップは、分析する材料のサイズに応じてGO窓を有するマイクロホールの深さを制御することによって、硝子体氷層の厚さを調節するように設計されています。GOウィンドウを備えたマイクロパターンチップは、一連のMEMS技術と2Dナノシート転写法を使用?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-H.K.、S.K.、M.L.、J.P.は、基礎科学研究所からの財政的支援を認める(Grant No.IBS-R006-D1)。S.K.、M.L.、J.P.は、ソウル大学校(2021年)を通じたクリエイティブ・パイオニア研究者プログラムからの財政的支援と、韓国政府(MSIT;グラント番号NRF-2020R1A2C2101871、およびNRF-2021M3A9I4022936)。M.L.とJ.P.は、ポスコTJパーク財団のポスコ科学フェローシップと韓国政府(MSIT;付与番号NRF-2017R1A5A1015365)。JPは、韓国政府(MSIT;付与番号NRF-2020R1A6C101A183)、ソウル大学校工学部・医学部による学際的研究イニシアティブプログラム(2021年)。M.-H.K.は、韓国政府(MSIT;付与番号NRF-2020R1I1A1A0107416612)。著者らは、ソウル大学高分子・細胞イメージングセンター(SNU CMCI)のスタッフとクルーに、クライオEM実験に対するたゆまぬ努力と忍耐力に感謝している。著者らは、FIB-SEM実験の支援をしてくれた国立大学共同利用研究センターのS. J. Kim氏に感謝する。
Materials
| 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
| Acetone | |||
| AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
| Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
| AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
| Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
| Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
| Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
| Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
| Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
| Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
| Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
| maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
| Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
| Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
| Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
| SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
| Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
| Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
| TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |
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