المجهر الإلكتروني للانتقال في الموقع الناجم عن الضوء لمراقبة تفاعل المادة السائلة اللينة
Summary
يصف هذا البروتوكول تعديلات المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) مع نظام إضاءة الضوء ، وتصنيع الخلايا السائلة ، وملاحظات TEM في الموقع للتفاعلات الناجمة عن الضوء بين الخلايا البكتيرية والمحسس الضوئي. كما تتم مناقشة طرق تحضير العينات وتلف شعاع الإلكترون والتصوير.
Abstract
يصف البروتوكول الحالي تعديلات إعداد المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) للملاحظات التي يسببها الضوء في الموقع . تم إدخال ألياف بصرية زجاجية في عمود الإلكترون فوق قطب العدسة الموضوعي ، وتم استخدام الليزر ، وهو مصدر ضوء قابل للتعديل ، لتصنيع الجهاز. بعد معايرة المصباح باستخدام نظام قياس خارجي ، فإنه يسمح للمرء بضبط شدة الإضاءة وفقا لاحتياجات العملية المرصودة. تم استخدام نظام الإضاءة هذا لتصوير ظواهر العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات ، والتي تخضع حاليا لبحث مكثف. تم تحضير العينة عن طريق اكتشاف تعليق البكتيريا على ركيزة الكربون أو الجرافين أو نيتريد السيليكون ، ونشاف المحلول الزائد ، واكتشاف محلول التحسس الضوئي ، ونشاف السائل الزائد مرة أخرى ، ثم تجميع الخلية السائلة مع ركيزة ثانية أو فيلم جرافين. تتضمن عملية تجربة التصوير نفسها اختيار المكان المناسب للمراقبة باستخدام تكبير منخفض وجرعة دنيا من الإلكترونات ، ثم التنشيط الدوري لمصدر الضوء لالتقاط صور لاحقة على فترات زمنية محددة بأقل قدر ممكن من الإلكترونات اللازمة. يجب تسجيل جرعة الإلكترون لكل تعرض ووقت وشدة الإضاءة المستخدمة بعناية بسبب تعقيد الظواهر المرصودة ، حيث أن العملية ، في الوقت نفسه ، مدفوعة بالضوء والإلكترون. بعد إجراء التجربة الفعلية ، يجب إجراء ملاحظات تحكم إضافية ، حيث يتم استخدام نفس جرعات الإلكترونات ولكن دون تأثير ضوئي إضافي ويتم استخدام جرعات أصغر من الإلكترونات لجرعات أعلى من الضوء. وهذا يجعل من الممكن التمييز بين التأثيرات الهيكلية المجهرية الناجمة عن الضوء وتلك التي تسببها الإلكترونات في كل من مجالات الحياة وعلوم المواد.
Introduction
الظواهر التي يسببها الضوء بدقة عالية مثيرة للاهتمام في العديد من المجالات مثل الهندسة النانوية1،2،3 ، والتحفيز4،5 ، والضوئيات الحيوية6. يمكن العثور على بعض التصاميم الأصلية التي تسمح بمثل هذه التجارب في الأدبيات ، بما في ذلك تعديلات أصحاب العينات1،4،7،8،9 والألياف البصرية المرفقة بالمجهر10،11.
إن الجمع بين الإضاءة الضوئية والبيئة السائلة والمجهر الإلكتروني الناقل (TEM) يعطي فرصة كبيرة للدراسات التفصيلية والديناميكية للعمليات المستحثة بالصور. ومع ذلك ، فإن حالة الفراغ العالي داخل المجهر غير مواتية إلى حد ما للعديد من السوائل ، وخاصة المحاليل المائية. يمكن تحقيق التغليف السائل ، الذي يحميه من البيئة ، باستخدام بعض التقنيات التي تعتمد بشكل أساسي على ركائز الجرافين 12 أو نيتريد السيليكون13 أو الكربون14. بالإضافة إلى الأبحاث في علوم المواد2 ، توفر ما يسمى بالخلايا السائلة إمكانيات لإجراء ملاحظات مجهرية غير تقليدية على العينات البيولوجية بالقرب من ظروفها الأصلية15. هذه الملاحظات صعبة للغاية ، خاصة بالنسبة للكائنات الحية الدقيقة مثل الخلايا البكتيرية. تسبب حزمة الإلكترون كإشعاع مؤين أضرارا لا رجعة فيها للعينات المائية ، لذلك يجب تحديد جرعة الإلكترون16. هذا ضروري لتقليل الآثار غير المواتية ، والتحكم في الضرر ، وتجنب القطع الأثرية المربكة. لا تزال الجرعة القصوى المثلى للإلكترون التي تسمح بمراقبة الخلايا الحية موضوعا مشكوكا فيه16 ، ولكن يبدو أن جرعة 30 e− / nm2 هي قيمة العتبة ، على الأقل بالنسبة للبكتيريا17.
بعض الموضوعات ذات الاهتمام لمثل هذه الدراسات المجهرية هي عمليات أثناء العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (APDT)18. باختصار ، يستمر العلاج على النحو التالي. الخلايا البكتيرية محاطة بسائل حساس للضوء يسمى المحسس الضوئي. عندما يتم إعطاء إضاءة ضوئية بطول موجي محدد ، يتم توليد أنواع الأكسجين التفاعلي السام للخلايا (ROS) من الطاقة أو نقل الشحنة من جزيئات المحسس الضوئي المثارة إلى الأكسجين الموجود بشكل طبيعي في المحلول. يتم تعطيل مسببات الأمراض المعرضة ل ROS بسرعة بكفاءة عالية جدا ، دون أي آثار جانبية19. تختلف الاستجابة للعلاج بالنسبة للميكروبات المتميزة – على سبيل المثال ، قد يكون تأثير نفس المحسس الضوئي مختلفا تماما بالنسبة للبكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام20. بشكل عام ، ثبت أن الهدف الرئيسي ل ROS هو الهياكل الخارجية للخلايا ، حيث يؤدي الضرر إلى اضطرابات وظيفية في غشاء الخلية ، وبالتالي يؤدي إلى وفاة البكتيريا21,22. ومع ذلك ، فإن تلف الأحماض النووية والبروتيناتيمكن اعتباره أيضا سببا للتعطيل18 ، لذلك لا يزال من غير المعروف أي هياكل الخلايا هي الأهداف الرئيسية خلال هذه العملية19. يمكن أن يساعد الفهم الأعمق للعمليات الضارة في تحسين هذا العلاج النهائي. بالمقارنة مع طرق الفحص المجهري الضوئي المستخدمة في أبحاث APDT23 ، توفر تقنيات TEM المزيد من الإمكانيات للنظر إلى آلية APDT بدقة أعلى وتكبير24. تم بالفعل استخدام TEM بنجاح لمراقبة الخلايا أثناء العلاج المستمر ، مما سمح لنا بدراسة تلف البكتيريا إيجابية الجرام ووصف التغييرات التي تحدث داخل جدار الخلية بالتفصيل 6,25.
يقدم البروتوكول الحالي إعدادا تجريبيا مناسبا للتصوير عالي الدقة لتعطيل البكتيريا المستحثة بالضوء باستخدام TEM ، والذي يتطلب نظاما مناسبا لإضاءة الضوء ، وتغليف الخلايا بسائل ، والتحكم الصارم في جرعة الإلكترون. كانت البكتيريا المستخدمة في الملاحظة هي المكورات العنقودية الذهبية ، وتم استخدام محلول أزرق الميثيلين كمحسس للضوء. يتكون إعداد الإضاءة الضوئية الخاص من ليزر أشباه موصلات قابل للضبط متصل مباشرة بعمود المجهر باستخدام الألياف الضوئية. يوفر هذا التصميم تشعيعا موحدا في جميع أنحاء العينة بسبب الوضع المتوازي تقريبا للألياف البصرية على محور المجهر. يمكن بعد ذلك استخدام الضوء أحادي اللون ذي الكثافة العالية الناتج عن الليزر لدراسة التأثيرات الكيميائية الضوئية المختلفة. كان للضوء المستخدم في التجربة طول موجي يساوي 660 نانومتر لأنه في المنطقة المرئية ، يكون للميثيلين الأزرق قمم امتصاص عند 613 نانومتر و 664 نانومتر26. يعتمد بروتوكول تغليف السائل على ركائز الكربون ، مما يجعل الإجراء سريعا وغير معقد. أخيرا ، يتم تقديم طريقة لجرعة منخفضة في الموقع TEM مراقبة الخلايا في السائل. وتناقش الصعوبات المتعلقة بإعداد العينة، وتأثيرات جرعة الإلكترون على العينة الحساسة، وتفسير الصورة المعقول.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتطلب تركيب وتشغيل المصباح معرفة أساسية بالخدمة ويمكن أن يتلف المجهر. أبسط طريقة لإدخال الضوء إلى المجهر هي توصيل الألياف البصرية من أعلى العدسة الموضوعية ، حيث يوجد عادة مجال لملفات انحراف TEM وأجهزة الكشف الإضافية. يمكن أيضا توقع المزيد من المساحة الحرة من أجهزة الدخول العلوية القديمة ، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم البحث من خلال منحة Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100 ، المركز الوطني للعلوم ، بولندا).
Materials
| Carbon film on 200 mesh copper grid | Agar Scientific | AGS160 | The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation |
| Crossover Tweezers | Dumont | N5 | The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation |
| Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S130C | The sensor used for light intensity measurement |
| Polyimide-Coated Multimode Fiber | Thorlabs | FG400UEP | Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388 |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | H-800 | Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification |
| Tuneable Diode Laser | CNI | MRL-III-660D | The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum |
References
- Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
- Weng, B., et al. Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM. Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).
- Cao, K., et al. In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries. Nano Energy. 40, 187-194 (2017).
- Cavalca, F., et al. In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions. Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).
- Tung, C. -. W., et al. Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction. Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).
- Shindo, D., et al. Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).
- Zhang, C., et al. Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests. Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).
- Zhang, C., et al. Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM. Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).
- Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films. Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).
- Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid. Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).
- Textor, M., De Jonge, N. Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy. Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
- Ring, E. A., De Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).
- Inayoshi, Y., Minoda, H. A carbon sandwich environmental cell for wet specimens. Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).
- Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live cell electron microscopy using graphene veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
- De Jonge, N., Peckys, D. B. Live cell electron microscopy is probably impossible. ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).
- Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to "live cell electron microscopy is probably impossible.". ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).
- Alves, E., et al. An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation. Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).
- Cieplik, F., et al. Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don’t. Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).
- Huang, L., et al. Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria. Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).
- Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).
- Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria. Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).
- Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).
- Maldonado-Carmona, N., et al. Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application. Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy. Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).
- Dinh, V. P., et al. Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel. RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).
- Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058 (2021).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Miller, B. K., Crozier, P. A. System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples. Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Schneider, N. M., et al. Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).
