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Ingénierie

액체-연질 물질 상호 작용 관찰을 위한 광 유도 현장 투과 전자 현미경

Published: July 26, 2022
doi:
10.3791/63742
,
1Electron Microscopy Laboratory, Faculty of Mechanical Engineering,Wroclaw University of Science and Technology, 2Advanced Materials Engineering and Modelling Group, Faculty of Chemistry,Wroclaw University of Science and Technology

Summary

본 프로토콜은 광 조명 시스템을 사용한 투과 전자 현미경(TEM) 변형, 액체 세포의 제조 및 박테리아 세포와 감광제 간의 광 유도 상호작용에 대한 현장 TEM 관찰을 설명합니다. 샘플 준비 방법, 전자빔 손상 및 이미징에 대해서도 설명합니다.

Abstract

현재 프로토콜은 현장 광 유도 관찰을 위한 투과 전자 현미경(TEM) 설정의 수정을 설명합니다. 대물 렌즈 폴피스 위의 전자 기둥에 삽입된 유리 광섬유와 조정 가능한 광원인 레이저를 사용하여 장치를 제작했습니다. 외부 측정 시스템을 사용하여 조명기를 보정한 후에는 관찰된 프로세스의 필요에 맞게 조명 강도를 조정할 수 있습니다. 이 조명 시스템은 현재 집중적인 연구 대상인 항균 광역학 치료 현상을 이미지화하는 데 활용되었습니다. 샘플은 탄소, 그래핀 또는 질화규소 기판 상에 박테리아의 현탁액을 발견하고, 과잉 용액을 블롯팅하고, 광감작제 용액을 스팟팅하고, 과잉 액체를 다시 블롯팅한 다음, 액체 셀을 제2 기판 또는 그래핀 필름으로 조립함으로써 제조되었다. 이미징 실험 자체의 프로세스에는 저배율 및 최소 전자 용량을 사용하여 관찰하기에 적합한 장소를 선택한 다음 광원을 주기적으로 활성화하여 필요한 최소 전자 양으로 지정된 간격으로 후속 이미지를 캡처하는 작업이 포함됩니다. 각 노출의 전자 선량과 사용 된 조명의 시간 및 강도는 관찰 된 현상의 복잡성으로 인해 신중하게 기록해야하며, 동시에 프로세스는 빛과 전자에 의해 구동됩니다. 실제 실험이 수행 된 후에는 동일한 양의 전자가 사용되지만 추가적인 빛의 영향이없고 더 적은 양의 전자가 더 많은 양의 빛에 사용되는 추가 제어 관찰이 이루어져야합니다. 이를 통해 생명 및 재료 과학 분야에서 전자로 인한 미세 구조 효과와 광유도 미세 구조 효과를 구별 할 수 있습니다.

Introduction

고해상도의 광 유도 현상은 나노 공학 1,2,3, 촉매 작용 4,5 및 바이오 포토닉스6과 같은 많은 분야에서 흥미 롭습니다. 이러한 실험을 허용하는 일부 독창적 인 디자인은 샘플 홀더 (1,4,7,8,9) 및 현미경 (10,11)에 부착 된 광섬유의 변형을 포함하여 문헌에서 찾을 수있다.

광 조명, 액체 환경 및 투과 전자 현미경(TEM)의 조합은 광 유도 프로세스에 대한 상세하고 역동적인 연구를 위한 좋은 기회를 제공합니다. 그러나 현미경 내부의 고진공 상태는 많은 액체, 특히 수용액에 다소 불리합니다. 환경으로부터 보호하는 액체 캡슐화는 주로 그래핀 12, 질화규소13 또는 탄소14 기판을 기반으로 하는 몇 가지 기술을 사용하여 달성할 수 있습니다. 재료 과학2에 대한 연구 외에도, 소위 액체 세포는 본래의 조건15 근처에서 생물학적 표본에 대해 비전통적인 현미경 관찰을 수행할 수 있는 가능성을 제공합니다. 이러한 관찰은 특히 박테리아 세포와 같은 살아있는 미생물에 대해 매우 까다 롭습니다. 전리 방사선으로서의 전자빔은 수화 된 표본에 돌이킬 수없는 손상을 일으키므로 전자 선량을 지정해야합니다16. 이는 불리한 영향을 최소화하고 손상을 제어하며 혼란스러운 아티팩트를 피하기 위해 필요합니다. 살아있는 세포의 관찰을 허용하는 최적의 최대 전자 선량은 여전히 의심스러운 주제16이지만, 적어도 박테리아17에 대해서는 30 e− / nm2 의 선량이 임계 값 인 것으로 보인다.

이러한 현미경 연구에서 관심 대상 중 일부는 항균 광역학 요법(APDT)18 동안의 과정입니다. 요컨대, 치료는 다음과 같이 진행됩니다. 박테리아 세포는 감광제라고 하는 감광성 액체로 둘러싸여 있습니다. 특정 파장에서 광 조명이 주어지면 세포 독성 활성 산소 종 (ROS)은 여기 된 광감작 제 분자에서 용액에 자연적으로 존재하는 산소로의 에너지 또는 전하 전달로부터 생성됩니다. ROS에 노출 된 병원체는 부작용없이 매우 높은 효율로 빠르게 비활성화됩니다19. 치료에 대한 반응은 별개의 미생물에 따라 다릅니다 – 예를 들어, 동일한 광감작제의 영향은 그람 양성균 및 그람 음성 박테리아20에 대해 상당히 다를 수 있습니다. 일반적으로 ROS의 주요 표적은 세포의 외부 구조이며, 손상은 세포막의 기능 장애를 초래하고 결과적으로 박테리아21,22의 죽음으로 이어진다는 것이 확인되었습니다. 그러나, 핵산 및 단백질 스캔에 대한 손상은 또한 불활성화의 원인으로 간주될 수 있다(18), 따라서, 이 과정 동안에 어떤 세포 구조가 주요 표적인지는 아직 알려지지 않았다(19). 손상 과정에 대한 더 깊은 이해는이 결정적인 치료법을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. APDT 연구23에 사용된 광학 현미경 방법과 비교하여, TEM 기술은 더 높은 해상도 및 배율24로 APDT 메커니즘을 볼 수 있는 더 많은 가능성을 제공한다. TEM은 이미 진행중인 치료 중 세포 관찰에 성공적으로 사용되어 그람 양성균 손상을 연구하고 변화세포벽 내에서 발생하는 6,25를 자세히 설명 할 수있었습니다.

현재 프로토콜은 적절한 조명 시스템, 액체로 세포 캡슐화 및 엄격한 전자 선량 제어가 필요한 TEM을 사용하여 광 유도 박테리아 불활성화의 고해상도 이미징에 적합한 실험 설정을 제공합니다. 관찰에 사용 된 박테리아는 황색 포도상 구균이었고 메틸렌 블루 용액은 감광제로 사용되었습니다. 특수 조명 설정은 광 섬유를 사용하여 현미경 컬럼에 직접 연결된 조정 가능한 반도체 레이저로 구성됩니다. 이 설계는 광섬유를 현미경 축에 거의 평행하게 배치하기 때문에 샘플 전체에 균일한 조사를 제공합니다. 레이저에 의해 생성 된 고강도의 단색광은 다양한 광화학 효과를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 실험에 사용 된 빛은 가시 영역에서 메틸렌 블루가 613nm 및 664nm26에서 흡수 피크를 갖기 때문에 660nm와 동일한 파장을 가졌습니다. 액체 캡슐화를 위한 프로토콜은 탄소 기질을 기반으로 하므로 절차가 빠르고 복잡하지 않습니다. 마지막으로, 액체 중 세포의 저용량 현장 TEM 관찰을 위한 방법이 제시된다. 샘플 준비에 관한 어려움, 민감한 샘플에 대한 전자 선량 효과 및 합리적인 이미지 해석에 대해 논의합니다.

Protocol

1. 투과 전자 현미경 수정 광섬유( 재료 표 참조)를 대물 렌즈 상단의 현미경 칼럼에 연결하여 투과 전자 현미경을 수정합니다. 대물 렌즈와 콘덴서 렌즈 사이에 몇 센티미터의 공간과 액세서리를 위한 여유 슬롯을 확보하십시오.참고: 전용 샘플 홀더(4 ) 또는 역구성(1 )에서의 음극발광 관찰을 위한 홀더가 또한 사용될 수 있?…

Representative Results

실험 설정은 고해상도로 액체에서 발생하는 광 유도 과정을 관찰하도록 설계되었습니다. 이미지의 경쟁 분석을 통해 전자빔으로 인한 손상과 광화학 반응과 관련된 변화를 구별 할 수있었습니다. 민감한 표본 (이 경우 액체로 캡슐화 된 세포)에 대한 전자빔의 효과는 전자가 균일하게 침투함에 따라 조사 된 영역 전체에서 볼 수있었습니다. 물론 효과는 전자 선량에 따라 다르므로 더 집중된 빔을…

Discussion

조명기의 설치 및 시운전에는 기본적인 서비스 지식이 필요하며 현미경이 손상될 수 있습니다. 현미경에 빛을 도입하는 가장 간단한 방법은 일반적으로 TEM 편향 코일과 추가 검출기를 위한 공간이 있는 대물 렌즈 상단에서 광섬유를 연결하는 것입니다. 동일한 위치에 샘플 진공 잠금 장치와 샘플 설치 메커니즘이 있는 구형 상단 입력 장치에서도 더 많은 여유 공간을 기대할 수 있습니다. 이러한 …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 Miniatura 보조금 (2019 / 03 / X / NZ3 / 02100, 폴란드 국립 과학 센터)의 지원을 받았습니다.

Materials

Carbon film on 200 mesh copper grid Agar Scientific AGS160 The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover Tweezers Dumont N5 The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power Sensor ThorLabs S130C The sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode Fiber Thorlabs FG400UEP Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron Microscope Hitachi H-800 Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode Laser CNI MRL-III-660D The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum
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Citer Cet Article
Żak, A., Kaczmarczyk, O. Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction. J. Vis. Exp. (185), e63742, doi:10.3791/63742 (2022).
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