Microscopie électronique à transmission in situ induite par la lumière pour l’observation de l’interaction liquide-matière molle

Summary

Le présent protocole décrit les modifications au microscope électronique à transmission (MET) avec un système d’éclairage lumineux, la fabrication de cellules liquides et les observations TEM in situ des interactions induites par la lumière entre les cellules bactériennes et un photosensibilisant. Les méthodes de préparation des échantillons, les dommages causés par le faisceau d’électrons et l’imagerie sont également abordés.

Abstract

Le protocole actuel décrit les modifications apportées à la configuration du microscope électronique à transmission (MET) pour les observations in situ induites par la lumière. Une fibre optique de verre insérée dans la colonne d’électrons au-dessus du pôle de l’objectif et un laser, une source de lumière réglable, ont été utilisés pour fabriquer le dispositif. Une fois l’illuminateur étalonné à l’aide d’un système de mesure externe, il permet d’ajuster l’intensité de l’éclairage aux besoins du processus observé. Ce système d’éclairage a été utilisé pour imager les phénomènes de thérapie photodynamique antimicrobienne, qui font actuellement l’objet d’intenses recherches. L’échantillon a été préparé en repérant une suspension de bactéries sur un substrat de carbone, de graphène ou de nitrure de silicium, en buvant la solution excédentaire, en repérant la solution photosensibilisante, en buvant à nouveau l’excès de liquide, puis en assemblant la cellule liquide avec un deuxième substrat ou film de graphène. Le processus de l’expérience d’imagerie elle-même comprend le choix du bon endroit pour l’observation avec l’utilisation d’un faible grossissement et d’une dose minimale d’électrons, puis l’activation cyclique de la source lumineuse pour capturer les images suivantes à des intervalles spécifiés avec le minimum d’électrons nécessaire. La dose d’électrons de chaque exposition ainsi que le temps et l’intensité de l’éclairage utilisé doivent être soigneusement enregistrés en raison de la complexité des phénomènes observés car, en même temps, le processus est à la fois entraîné par la lumière et par les électrons. Une fois l’expérience proprement dite, des observations de contrôle supplémentaires doivent être faites, dans lesquelles les mêmes doses d’électrons sont utilisées mais sans influence lumineuse supplémentaire et de plus petites doses d’électrons sont utilisées pour des doses plus élevées de lumière. Cela permet de distinguer les effets microstructuraux induits par la lumière de ceux causés par les électrons dans les domaines de la vie et de la science des matériaux.

Introduction

Les phénomènes induits par la lumière en haute résolution sont intéressants dans de nombreux domaines tels que la nanotechnique 1,2,3, la catalyse ^4,5 et la biophotonique⁶. Certains modèles originaux qui permettent de telles expériences peuvent être trouvés dans la littérature, y compris les modifications des porte-échantillons 1,4,7,8,9 et de la fibre optique fixée au microscope ^10,11.

La combinaison de l’éclairage lumineux, d’un environnement liquide et de la microscopie électronique à transmission (MET) offre une excellente occasion d’étudier en détail et dynamiquement les processus photo-induits. Cependant, la condition de vide poussé à l’intérieur du microscope est plutôt défavorable pour de nombreux liquides, en particulier les solutions aqueuses. L’encapsulation liquide, qui le protège de l’environnement, peut être réalisée à l’aide de quelques techniques basées principalement sur des substrats de graphène¹², de nitrure de silicium 13 ou de carbone¹⁴. En plus de la recherche en science des matériaux², les cellules dites liquides offrent des possibilités pour effectuer des observations microscopiques non conventionnelles sur des spécimens biologiques proches de leurs conditions natives¹⁵. De telles observations sont extrêmement exigeantes, en particulier pour les micro-organismes vivants tels que les cellules bactériennes. Le faisceau d’électrons en tant que rayonnement ionisant provoque des dommages irréversibles aux échantillons hydratés, de sorte que la dose d’électrons doit être spécifiée¹⁶. Cela est nécessaire pour minimiser les effets défavorables, contrôler les dommages et éviter les artefacts confus. La dose maximale optimale d’électrons qui permet d’observer les cellules vivantes est encore un sujet discutable¹⁶, mais la dose de 30 e⁻/^nm2 semble être la valeur seuil, du moins pour les bactéries¹⁷.

Certains des sujets d’intérêt pour de telles études microscopiques sont les processus au cours de la thérapie photodynamique antimicrobienne (APDT)¹⁸. En bref, la thérapie se déroule comme suit. Les cellules bactériennes sont entourées par le liquide photosensible appelé photosensibilisant. Lorsque l’éclairage lumineux est donné à une longueur d’onde spécifique, les espèces réactives cytotoxiques de l’oxygène (ROS) sont générées par transfert d’énergie ou de charge des molécules photosensibilisatrices excitées à l’oxygène naturellement présent dans la solution. Les agents pathogènes exposés aux ROS sont rapidement inactivés avec une très grande efficacité, sans effets secondaires¹⁹. La réponse à la thérapie varie pour des microbes distincts – par exemple, l’impact du même photosensibilisateur peut être très différent pour les bactéries à Gram positif et à Gram négatif²⁰. En général, il a été établi que la cible principale des ROS est les structures externes des cellules, où les dommages entraînent des troubles fonctionnels de la membrane cellulaire et, par conséquent, conduisent à la mort des bactéries^21,22. Cependant, les dommages aux acides nucléiques et aux protéines peuvent également être considérés comme une cause d’inactivation¹⁸, de sorte qu’on ne sait toujours pas quelles structures cellulaires sont les principales cibles au cours de ce processus¹⁹. Une meilleure compréhension des processus dommageables pourrait aider à améliorer cette thérapie définitive. Par rapport aux méthodes de microscopie optique utilisées dans la recherche APDT²³, les techniques TEM offrent plus de possibilités d’examiner le mécanisme APDT avec une résolution et un grossissement^{plus élevés 24}. La TEM a déjà été utilisée avec succès pour l’observation cellulaire au cours du traitement en cours, ce qui nous a permis d’étudier les dommages bactériens à Gram positif et de décrire en détail les changements qui se produisent dans la paroi cellulaire ^6,25.

Le protocole actuel présente une configuration expérimentale appropriée pour l’imagerie à haute résolution de l’inactivation des bactéries induite par la lumière à l’aide de la MET, ce qui nécessite un système d’éclairage lumineux approprié, l’encapsulation des cellules avec un liquide et un contrôle strict de la dose d’électrons. La bactérie utilisée pour l’observation était Staphylococcus aureus, et une solution de bleu de méthylène a été utilisée comme photosensibilisant. La configuration spéciale d’éclairage lumineux comprend un laser à semi-conducteur accordable connecté directement à la colonne du microscope à l’aide de la fibre lumineuse. Cette conception assure une irradiation uniforme dans tout l’échantillon en raison du placement presque parallèle de la fibre optique à l’axe du microscope. La lumière monochromatique de haute intensité générée par le laser peut ensuite être utilisée pour étudier divers effets photochimiques. La lumière utilisée dans l’expérience avait une longueur d’onde égale à 660 nm car, dans la région visible, le bleu de méthylène a des pics d’absorption à 613 nm et 664 nm²⁶. Le protocole d’encapsulation liquide est basé sur des substrats de carbone, ce qui rend la procédure rapide et simple. Enfin, une méthode d’observation TEM in situ à faible dose de cellules dans un liquide est présentée. Les difficultés concernant la préparation de l’échantillon, les effets de la dose d’électrons sur l’échantillon sensible et l’interprétation raisonnable de l’image sont discutés.

Protocol

1. Modification du microscope électronique à transmission Modifier le microscope électronique à transmission en connectant la fibre optique (voir Tableau des matériaux) à la colonne du microscope en haut de la lentille de l’objectif. Prévoyez quelques centimètres d’espace entre l’objectif et la lentille du condensateur, ainsi qu’un emplacement libre pour les accessoires.NOTE: Un porte-échantillondédié 4 ou un support pour les obser…

Representative Results

La configuration expérimentale a été conçue pour observer les processus induits par la lumière se produisant dans un liquide à haute résolution. L’analyse concurrentielle des images nous a permis de distinguer les dommages causés par le faisceau d’électrons des changements liés à la réaction photochimique. L’effet du faisceau d’électrons sur l’échantillon sensible (dans ce cas, les cellules encapsulées avec du liquide) était visible dans toute la zone irradiée lorsque les électrons la traversa…

Discussion

L’installation et la mise en service de l’illuminateur nécessitent des connaissances de base en matière de service et peuvent endommager le microscope. La façon la plus simple d’introduire la lumière dans le microscope est de connecter la fibre optique à partir du haut de la lentille de l’objectif, où il y a généralement de la place pour les bobines de déviation TEM et les détecteurs supplémentaires. On peut également s’attendre à plus d’espace libre avec les anciens dispositifs d’entrée par l…

Materials

Carbon film on 200 mesh copper grid	Agar Scientific	AGS160	The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover Tweezers	Dumont	N5	The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power Sensor	ThorLabs	S130C	The sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode Fiber	Thorlabs	FG400UEP	Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron Microscope	Hitachi	H-800	Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode Laser	CNI	MRL-III-660D	The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum