إنشاء الطعوم الخارجية المشتقة من مريض الزرد من سرطان البنكرياس لاختبار الحساسية الكيميائية
Summary
تهدف النماذج قبل السريرية إلى تعزيز المعرفة ببيولوجيا السرطان والتنبؤ بفعالية العلاج. تصف هذه الورقة جيل الطعوم الخارجية المشتقة من المرضى (zPDXs) القائمة على الزرد مع شظايا أنسجة الورم. تم علاج zPDXs بالعلاج الكيميائي ، وتم تقييم التأثير العلاجي من حيث موت الخلايا المبرمج للأنسجة المزروعة.
Abstract
السرطان هو أحد الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم ، ويستمر معدل الإصابة بالعديد من أنواع السرطان في الزيادة. وقد أحرز تقدم كبير فيما يتعلق بالفحص والوقاية والعلاج. ومع ذلك ، لا تزال النماذج قبل السريرية التي تتنبأ بملف الحساسية الكيميائية لمرضى السرطان غير موجودة. لسد هذه الفجوة ، تم تطوير نموذج xenograft المشتق من المريض في الجسم الحي والتحقق من صحته. استند النموذج إلى أجنة الزرد (Danio rerio) في 2 أيام بعد الإخصاب ، والتي تم استخدامها كمتلقين لشظايا xenograft من أنسجة الورم المأخوذة من عينة جراحية للمريض.
ومن الجدير بالذكر أيضا أن العينات ثنائية البصر لم يتم هضمها أو تفكيكها ، من أجل الحفاظ على البيئة المكروية للورم ، وهو أمر بالغ الأهمية من حيث تحليل سلوك الورم والاستجابة للعلاج. يفصل البروتوكول طريقة لإنشاء الطعوم الخارجية المشتقة من المريض (zPDXs) من الاستئصال الجراحي للورم الصلب الأولي. بعد الفحص من قبل أخصائي علم التشريح ، يتم تشريح العينة باستخدام شفرة مشرط. تتم إزالة الأنسجة الميتة أو الأوعية أو الأنسجة الدهنية ثم تقطيعها إلى قطع 0.3 مم × 0.3 مم × 0.3 مم.
ثم يتم وضع علامات على القطع الفلورية وزرعها في الفضاء المحيط بأجنة الزرد. يمكن معالجة عدد كبير من الأجنة بتكلفة منخفضة ، مما يتيح إجراء تحليلات عالية الإنتاجية في الجسم الحي للحساسية الكيميائية ل zPDXs للعديد من الأدوية المضادة للسرطان. يتم الحصول على الصور متحدة البؤر بشكل روتيني للكشف عن مستويات موت الخلايا المبرمج التي يسببها العلاج الكيميائي وتحديدها كميا مقارنة بالمجموعة الضابطة. يتمتع إجراء xenograft بميزة زمنية كبيرة ، حيث يمكن إكماله في يوم واحد ، مما يوفر نافذة زمنية معقولة لإجراء فحص علاجي للتجارب السريرية المشتركة.
Introduction
تتمثل إحدى مشاكل أبحاث السرطان السريرية في أن السرطان ليس مرضا واحدا ، ولكنه مجموعة متنوعة من الأمراض المختلفة التي يمكن أن تتطور بمرور الوقت ، مما يتطلب علاجات محددة اعتمادا على خصائص الورم نفسه والمريض1. وبالتالي ، فإن التحدي هو التحرك نحو أبحاث السرطان الموجهة نحو المريض ، من أجل تحديد استراتيجيات شخصية جديدة للتنبؤ المبكر بنتائج علاج السرطان2. هذا مهم بشكل خاص للسرطان الغدي القنوي البنكرياسي (PDAC) ، لأنه يعتبر سرطانا يصعب علاجه ، بمعدل بقاء لمدة 5 سنوات يبلغ 11٪ 3.
لا يزال التشخيص المتأخر والتقدم السريع ونقص العلاجات الفعالة هي المشاكل السريرية الأكثر إلحاحا ل PDAC. لذلك ، يتمثل التحدي الرئيسي في نمذجة المريض وتحديد المؤشرات الحيوية التي يمكن تطبيقها في العيادة لاختيار العلاج الأكثر فعالية بما يتماشى مع الطب الشخصي4،5،6. بمرور الوقت ، تم اقتراح مناهج جديدة لنمذجة أمراض السرطان: نشأت الكائنات العضوية المشتقة من المريض (PDOs) والطعوم الخارجية المشتقة من مريض الفئران (mPDXs) من مصدر لأنسجة الورم البشري. لقد تم استخدامها لإعادة إنتاج المرض لدراسة الاستجابة ومقاومة العلاج ، وكذلك تكرار المرض7،8،9.
وبالمثل ، زاد الاهتمام بنماذج xenograft المشتقة من المرضى (zPDX) القائمة على الزرد ، وذلك بفضل خصائصها الفريدة والواعدة10 ، والتي تمثل أداة سريعة ومنخفضة التكلفة لأبحاث السرطان11,12. تتطلب نماذج zPDX حجم عينة ورم صغير فقط ، مما يجعل الفحص عالي الإنتاجية للعلاج الكيميائي ممكنا13. تعتمد التقنية الأكثر شيوعا المستخدمة في نماذج zPDX على هضم العينة الكاملة وزرع مجموعات الخلايا الأولية ، والتي تعيد إنتاج الورم جزئيا ، ولكن لها عيوب نقص البيئة المكروية للورم والحديث المتبادل بين الخلايا الخبيثة والسليمة14.
يوضح هذا العمل كيف يمكن استخدام zPDXs كنموذج قبل السريري لتحديد ملف تعريف الحساسية الكيميائية لمرضى سرطان البنكرياس. تسهل الاستراتيجية القيمة عملية الكسب غير المشروع ، حيث لا توجد حاجة لتوسيع الخلايا ، مما يسمح بتسريع فحص العلاج الكيميائي. تكمن قوة النموذج في الحفاظ على جميع مكونات البيئة المكروية كما هي في أنسجة سرطان المريض ، لأنه ، كما هو معروف ، يعتمد سلوك الورم على تفاعلها15,16. هذا مناسب للغاية على الطرق البديلة في الأدبيات ، حيث أنه من الممكن الحفاظ على عدم تجانس الورم والمساهمة في تحسين القدرة على التنبؤ بنتائج العلاج والانتكاس بطريقة خاصة بالمريض ، وبالتالي تمكين استخدام نموذج zPDX في التجارب السريرية المشتركة. تصف هذه المخطوطة الخطوات المتبعة في صنع نموذج zPDX ، بدءا من قطعة من استئصال ورم المريض ومعالجته لتحليل الاستجابة للعلاج الكيميائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر النماذج في الجسم الحي في أبحاث السرطان أدوات لا تقدر بثمن لفهم بيولوجيا السرطان والتنبؤ باستجابة علاج السرطان. حاليا ، تتوفر نماذج مختلفة في الجسم الحي ، على سبيل المثال ، الحيوانات المعدلة وراثيا (الفئران المعدلة وراثيا والضربة القاضية) أو الطعوم الخارجية المشتقة من المري…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة بيزا (المشروع 114/16). يود المؤلفون أن يشكروا رافاييل جيتا من وحدة علم أمراض الأنسجة في Azienda Ospedaliera Pisana على اختيار عينة المريض ودعم علم الأمراض. كما نشكر أليسيا جالانتي على الدعم الفني في التجارب. تستند هذه المقالة إلى عمل من COST Action TRANSPAN ، CA21116 ، بدعم من COST (التعاون الأوروبي في العلوم والتكنولوجيا).
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
References
- Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O’Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
