Etablering af zebrafisk patientafledte xenotransplantater fra kræft i bugspytkirtlen til kemosensitivitetstest
Summary
Prækliniske modeller sigter mod at fremme viden om kræftbiologi og forudsige behandlingseffektivitet. Dette papir beskriver dannelsen af zebrafiskbaserede patientafledte xenotransplantater (zPDX’er) med tumorvævsfragmenter. zPDX’erne blev behandlet med kemoterapi, hvis terapeutiske virkning blev vurderet med hensyn til celleapoptose i det transplanterede væv.
Abstract
Kræft er en af de vigtigste dødsårsager på verdensplan, og forekomsten af mange typer kræft fortsætter med at stige. Der er gjort store fremskridt med hensyn til screening, forebyggelse og behandling; Der mangler dog stadig prækliniske modeller, der forudsiger kræftpatienters kemosensitivitetsprofil. For at udfylde dette hul blev der udviklet og valideret en in vivo patientafledt xenograftmodel. Modellen var baseret på zebrafisk (Danio rerio) embryoner 2 dage efter befrugtning, som blev brugt som modtagere af xenograft fragmenter af tumorvæv taget fra en patients kirurgiske prøve.
Det er også værd at bemærke, at bioptiske prøver ikke blev fordøjet eller disaggregeret for at opretholde tumormikromiljøet, hvilket er afgørende med hensyn til analyse af tumoradfærd og respons på terapi. Protokollen beskriver en metode til etablering af zebrafiskbaserede patientafledte xenotransplantater (zPDX’er) fra primær solid tumorkirurgisk resektion. Efter screening af en anatomiopatog dissekeres prøven ved hjælp af et skalpelblad. Nekrotisk væv, kar eller fedtvæv fjernes og hakkes derefter i stykker på 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm.
Stykkerne mærkes derefter fluorescerende og xenotransplanteres i perivitellinerummet hos zebrafiskembryoner. Et stort antal embryoner kan behandles til en lav pris, hvilket muliggør in vivo-analyser med høj kapacitet af zPDX’ers kemofølsomhed over for flere kræftlægemidler. Konfokale billeder erhverves rutinemæssigt for at detektere og kvantificere de apoptotiske niveauer induceret af kemoterapibehandling sammenlignet med kontrolgruppen. Xenograftproceduren har en betydelig tidsfordel, da den kan gennemføres på en enkelt dag, hvilket giver et rimeligt tidsvindue til at udføre en terapeutisk screening for cokliniske forsøg.
Introduction
Et af problemerne med klinisk kræftforskning er, at kræft ikke er en enkelt sygdom, men en række forskellige sygdomme, der kan udvikle sig over tid, hvilket kræver specifikke behandlinger afhængigt af selve tumorens egenskaber og patienten1. Derfor er udfordringen at bevæge sig mod patientorienteret kræftforskning for at identificere nye personaliserede strategier til tidlig forudsigelse af kræftbehandlingsresultater2. Dette er især relevant for pancreas ductal adenocarcinom (PDAC), da det betragtes som en svær at behandle kræft med en 5-årig overlevelsesrate på 11%3.
Den sene diagnose, hurtige progression og mangel på effektive terapier forbliver de mest presserende kliniske problemer med PDAC. Den største udfordring er derfor at modellere patienten og identificere biomarkører, der kan anvendes i klinikken for at vælge den mest effektive terapi på linje med personlig medicin 4,5,6. Over tid er der blevet foreslået nye tilgange til modellering af kræftsygdomme: patientafledte organoider (BDO’er) og musepatientafledte xenotransplantater (mPDX’er) stammer fra en kilde til humant tumorvæv. De er blevet brugt til at reproducere sygdommen for at studere responsen og modstanden mod terapi samt sygdomsgentagelse 7,8,9.
På samme måde er interessen for zebrafiskbaserede patientafledte xenograftmodeller (zPDX) steget takket være deres unikke og lovende egenskaber10, hvilket repræsenterer et hurtigt og billigt værktøj til kræftforskning11,12. zPDX-modeller kræver kun en lille tumorprøvestørrelse, hvilket gør screening med høj kapacitet af kemoterapi mulig13. Den mest almindelige teknik, der anvendes til zPDX-modeller, er baseret på fuldstændig prøvefordøjelse og implantation af de primære cellepopulationer, som delvist reproducerer tumoren, men har ulemperne ved mangel på tumormikromiljø og krydstale mellem ondartede og sunde celler14.
Dette arbejde viser, hvordan zPDX’er kan bruges som en præklinisk model til at identificere kemofølsomhedsprofilen hos patienter med kræft i bugspytkirtlen. Den værdifulde strategi letter xenograft-processen, da der ikke er behov for celleudvidelse, hvilket muliggør acceleration af kemoterapiscreeningen. Modellens styrke er, at alle mikromiljøkomponenterne opretholdes som de er i patientens kræftvæv, fordi tumorens opførsel som bekendt afhænger af deres samspil15,16. Dette er yderst gunstigt i forhold til alternative metoder i litteraturen, da det er muligt at bevare tumorheterogeniteten og bidrage til at forbedre forudsigeligheden af behandlingsresultatet og tilbagefald på en patientspecifik måde, hvilket gør det muligt at anvende zPDX-modellen i co-kliniske forsøg. Dette manuskript beskriver de trin, der er involveret i at lave zPDX-modellen, startende med et stykke patientstumorresektion og behandle det for at analysere responsen på kemoterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo-modeller i kræftforskning giver uvurderlige værktøjer til at forstå kræftbiologi og forudsige kræftbehandlingsresponsen. I øjeblikket findes der forskellige in vivo-modeller , f.eks. genetisk modificerede dyr (transgene mus og knockout-mus) eller patientafledte xenotransplantater fra humane primære celler. På trods af mange optimale funktioner har hver enkelt forskellige begrænsninger. Især mangler de ovennævnte modeller en pålidelig måde at efterligne patientens tumorvævsmikromil…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Fondazione Pisa (projekt 114/16). Forfatterne vil gerne takke Raffaele Gaeta fra Histopatologisk Enhed i Azienda Ospedaliera Pisana for patientprøveudvælgelsen og patologistøtten. Vi takker også Alessia Galante for den tekniske support i eksperimenterne. Denne artikel er baseret på arbejde udført af COST Action Transpan, CA21116, støttet af COST (European Cooperation in Science and Technology).
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
References
- Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O’Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
