केमोसेंसिटिविटी परीक्षण के लिए अग्नाशय के कैंसर से ज़ेबराफिश रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स की स्थापना
Summary
प्रीक्लिनिकल मॉडल का उद्देश्य कैंसर जीव विज्ञान के ज्ञान को आगे बढ़ाना और उपचार प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करना है। यह पेपर ट्यूमर ऊतक के टुकड़ों के साथ ज़ेबराफिश-आधारित रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (जेडपीडीएक्स) की पीढ़ी का वर्णन करता है। जेडपीडीएक्स को कीमोथेरेपी के साथ इलाज किया गया था, जिसके चिकित्सीय प्रभाव का मूल्यांकन प्रत्यारोपित ऊतक के सेल एपोप्टोसिस के संदर्भ में किया गया था।
Abstract
कैंसर दुनिया भर में मौत के मुख्य कारणों में से एक है, और कई प्रकार के कैंसर की घटनाओं में वृद्धि जारी है। स्क्रीनिंग, रोकथाम और उपचार के मामले में बहुत प्रगति हुई है; हालांकि, प्रीक्लिनिकल मॉडल जो कैंसर रोगियों की केमोसेंसिटिविटी प्रोफाइल की भविष्यवाणी करते हैं, अभी भी कमी है। इस अंतर को भरने के लिए, एक विवो रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल विकसित और मान्य किया गया था। मॉडल निषेचन के 2 दिनों के बाद जेब्राफिश (डेनियो रेरियो) भ्रूण पर आधारित था, जिसका उपयोग रोगी के सर्जिकल नमूने से लिए गए ट्यूमर ऊतक के जेनोग्राफ्ट टुकड़ों के प्राप्तकर्ताओं के रूप में किया गया था।
यह भी ध्यान देने योग्य है कि ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को बनाए रखने के लिए बायोप्टिक नमूने पचने या अलग-अलग नहीं थे, जो ट्यूमर व्यवहार और चिकित्सा की प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के संदर्भ में महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल प्राथमिक ठोस ट्यूमर सर्जिकल रिसेक्शन से ज़ेबराफिश-आधारित रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (जेडपीडीएक्स) स्थापित करने के लिए एक विधि का विवरण देता है। एनाटोमोपैथोलॉजिस्ट द्वारा स्क्रीनिंग के बाद, नमूना को स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके विच्छेदित किया जाता है। नेक्रोटिक ऊतक, वाहिकाओं, या वसायुक्त ऊतक को हटा दिया जाता है और फिर 0.3 मिमी x 0.3 मिमी x 0.3 मिमी टुकड़ों में काट दिया जाता है।
टुकड़ों को तब फ्लोरोसेंटली लेबल किया जाता है और ज़ेब्राफिश भ्रूण के पेरिविटेलिन स्पेस में एक्सनोट्रांसप्लांट किया जाता है। बड़ी संख्या में भ्रूण को कम लागत पर संसाधित किया जा सकता है, जिससे कई एंटीकैंसर दवाओं के लिए जेडपीडीएक्स की कीमोसेंसिटिविटी के विवो विश्लेषण में उच्च-थ्रूपुट सक्षम हो सकता है। नियंत्रण समूह की तुलना में कीमोथेरेपी उपचार द्वारा प्रेरित एपोप्टोटिक स्तरों का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए कॉन्फोकल छवियों को नियमित रूप से अधिग्रहित किया जाता है। जेनोग्राफ्ट प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण समय लाभ है, क्योंकि इसे एक ही दिन में पूरा किया जा सकता है, जो सह-नैदानिक परीक्षणों के लिए चिकित्सीय स्क्रीनिंग करने के लिए एक उचित समय खिड़की प्रदान करता है।
Introduction
नैदानिक कैंसर अनुसंधान की समस्याओं में से एक यह है कि कैंसर एक एकल बीमारी नहीं है, बल्कि विभिन्न बीमारियों की एक किस्म है जो समय के साथ विकसित हो सकती है, ट्यूमर की विशेषताओंऔर रोगी 1 के आधार पर विशिष्ट उपचार की आवश्यकता होती है। नतीजतन, चुनौती रोगी-उन्मुख कैंसर अनुसंधान की ओर बढ़ना है, ताकि कैंसरउपचार परिणामों की शुरुआती भविष्यवाणी के लिए नई व्यक्तिगत रणनीतियों की पहचान की जा सके। यह अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि इसे 11% 3 की 5 साल की जीवित रहने की दर के साथ एक कठिन-से-इलाज कैंसर माना जाता है।
देर से निदान, तेजी से प्रगति, और प्रभावी उपचारों की कमी पीडीएसी की सबसे अधिक दबाव वाली नैदानिक समस्याएं बनी हुई हैं। इसलिए, मुख्य चुनौती रोगी को मॉडल करना और बायोमार्कर की पहचान करना है जिसे व्यक्तिगत चिकित्सा 4,5,6 के अनुरूप सबसे प्रभावी चिकित्सा का चयन करने के लिए क्लिनिक में लागू किया जा सकता है। समय के साथ, कैंसर रोगों को मॉडल करने के लिए नए दृष्टिकोण प्रस्तावित किए गए हैं: रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) और माउस रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (एमपीडीएक्स) मानव ट्यूमर ऊतक के स्रोत से उत्पन्न हुए हैं। उनका उपयोग चिकित्सा की प्रतिक्रिया और प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए रोग को पुन: पेश करने के लिए किया गया है, साथ ही रोग पुनरावृत्ति 7,8,9 भी है।
इसी तरह, ज़ेबराफ़िश-आधारित रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (जेडपीडीएक्स) मॉडल में रुचि बढ़ी है, उनकी अनूठी और आशाजनक विशेषताओं 10 के लिए धन्यवाद, जो कैंसर अनुसंधान11,12 के लिए एक त्वरित और कम लागत वाले उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। जेडपीडीएक्स मॉडल को केवल एक छोटे ट्यूमर नमूना आकार की आवश्यकता होती है, जो कीमोथेरेपी की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को संभव बनाताहै। जेडपीडीएक्स मॉडल के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे आम तकनीक प्राथमिक कोशिका आबादी के पूर्ण नमूना पाचन और आरोपण पर आधारित है, जो आंशिक रूप से ट्यूमर को पुन: उत्पन्न करती है, लेकिन ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की कमी और घातक औरस्वस्थ कोशिकाओं के बीच क्रॉसटॉक के नुकसान हैं।
यह काम दिखाता है कि अग्नाशय के कैंसर रोगियों की केमोसेंसिटिविटी प्रोफाइल की पहचान करने के लिए जेडपीडीएक्स का उपयोग प्रीक्लिनिकल मॉडल के रूप में कैसे किया जा सकता है। मूल्यवान रणनीति जेनोग्राफ्ट प्रक्रिया की सुविधा प्रदान करती है, क्योंकि सेल विस्तार की कोई आवश्यकता नहीं है, जिससे कीमोथेरेपी स्क्रीनिंग के त्वरण की अनुमति मिलती है। मॉडल की ताकत यह है कि सभी माइक्रोएन्वायरमेंट घटकों को बनाए रखा जाता है क्योंकि वे रोगी कैंसर ऊतक में होते हैं, क्योंकि, जैसा कि यह अच्छी तरह से ज्ञात है, ट्यूमर का व्यवहार उनके अंतःक्रिया15,16 पर निर्भर करता है। यह साहित्य में वैकल्पिक तरीकों पर अत्यधिक अनुकूल है, क्योंकि ट्यूमर विषमता को संरक्षित करना और रोगी-विशिष्ट तरीके से उपचार के परिणाम और रिलैप्स की भविष्यवाणी में सुधार करने में योगदान करना संभव है, इस प्रकार जेडपीडीएक्स मॉडल को सह-नैदानिक परीक्षणों में उपयोग करने में सक्षम बनाता है। यह पांडुलिपि जेडपीडीएक्स मॉडल बनाने में शामिल चरणों का वर्णन करती है, जो रोगी ट्यूमर रिसेक्शन के एक टुकड़े से शुरू होती है और कीमोथेरेपी की प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए इसका इलाज करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैंसर अनुसंधान में विवो मॉडल कैंसर जीव विज्ञान को समझने और कैंसर उपचार प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैं। वर्तमान में, विवो मॉडल में अलग-अलग उपलब्ध हैं, उदाहरण ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को फोंडाज़ियोन पीसा (परियोजना 114/16) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक रोगी के नमूने के चयन और पैथोलॉजी समर्थन के लिए एज़िएन्डा ओस्पेडालीरा पिसाना की हिस्टोपैथोलॉजी यूनिट से राफेल गेटा को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम प्रयोगों में तकनीकी सहायता के लिए एलेसिया गैलेंटे को भी धन्यवाद देते हैं। यह लेख कॉस्ट एक्शन ट्रांसपैन, CA21116 से काम पर आधारित है, जो कॉस्ट (विज्ञान और प्रौद्योगिकी में यूरोपीय सहयोग) द्वारा समर्थित है।
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
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