Istituzione di xenotrapianti derivati da pazienti zebrafish da cancro del pancreas per test di chemiosensibilità
Summary
I modelli preclinici mirano a far progredire la conoscenza della biologia del cancro e a prevedere l’efficacia del trattamento. Questo articolo descrive la generazione di xenotrapianti derivati dal paziente (zPDX) a base di zebrafish con frammenti di tessuto tumorale. Gli zPDX sono stati trattati con chemioterapia, il cui effetto terapeutico è stato valutato in termini di apoptosi cellulare del tessuto trapiantato.
Abstract
Il cancro è una delle principali cause di morte in tutto il mondo e l’incidenza di molti tipi di cancro continua ad aumentare. Sono stati fatti molti progressi in termini di screening, prevenzione e trattamento; Tuttavia, mancano ancora modelli preclinici che prevedano il profilo di chemiosensibilità dei pazienti oncologici. Per colmare questa lacuna, è stato sviluppato e convalidato un modello di xenotrapianto derivato dal paziente in vivo . Il modello era basato su embrioni di zebrafish (Danio rerio) a 2 giorni dopo la fecondazione, che sono stati utilizzati come destinatari di frammenti di xenotrapianto di tessuto tumorale prelevati dal campione chirurgico di un paziente.
Vale anche la pena notare che i campioni bioptici non sono stati digeriti o disaggregati, al fine di mantenere il microambiente tumorale, che è cruciale in termini di analisi del comportamento del tumore e della risposta alla terapia. Il protocollo descrive un metodo per stabilire xenotrapianti derivati dal paziente (zPDX) a base di zebrafish dalla resezione chirurgica primaria del tumore solido. Dopo lo screening da parte di un anatomopatologo, il campione viene sezionato utilizzando una lama di bisturi. Il tessuto necrotico, i vasi o il tessuto adiposo vengono rimossi e quindi tagliati in pezzi da 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm.
I pezzi vengono quindi etichettati in modo fluorescente e xenotrapiantati nello spazio perivitellino degli embrioni di zebrafish. Un gran numero di embrioni può essere trattato a basso costo, consentendo analisi in vivo ad alto rendimento della chemiosensibilità degli zPDX a più farmaci antitumorali. Le immagini confocali vengono acquisite di routine per rilevare e quantificare i livelli apoptotici indotti dal trattamento chemioterapico rispetto al gruppo di controllo. La procedura di xenotrapianto ha un vantaggio temporale significativo, poiché può essere completata in un solo giorno, fornendo una finestra temporale ragionevole per effettuare uno screening terapeutico per gli studi co-clinici.
Introduction
Uno dei problemi della ricerca clinica sul cancro è che il cancro non è una singola malattia, ma una varietà di malattie diverse che possono evolvere nel tempo, richiedendo trattamenti specifici a seconda delle caratteristiche del tumore stesso e del paziente1. Di conseguenza, la sfida è quella di muoversi verso la ricerca sul cancro orientata al paziente, al fine di identificare nuove strategie personalizzate per la previsione precoce dei risultati del trattamento del cancro2. Ciò è particolarmente rilevante per l’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), poiché è considerato un tumore difficile da trattare, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni dell’11%3.
La diagnosi tardiva, la rapida progressione e la mancanza di terapie efficaci rimangono i problemi clinici più urgenti del PDAC. La sfida principale è, quindi, quella di modellare il paziente e identificare i biomarcatori che possono essere applicati in clinica per selezionare la terapia più efficace in linea con la medicina personalizzata 4,5,6. Nel corso del tempo, sono stati proposti nuovi approcci per modellare le malattie tumorali: organoidi derivati dal paziente (PDO) e xenotrapianti derivati dal paziente di topo (mPDX) hanno avuto origine da una fonte di tessuto tumorale umano. Sono stati utilizzati per riprodurre la malattia per studiare la risposta e la resistenza alla terapia, nonché la recidiva della malattia 7,8,9.
Allo stesso modo, l’interesse per i modelli di xenotrapianto derivati dal paziente (zPDX) basati sul pesce zebra è aumentato, grazie alle loro caratteristiche uniche e promettenti10, rappresentando uno strumento rapido e a basso costo per la ricerca sul cancro11,12. I modelli zPDX richiedono solo una piccola dimensione del campione tumorale, il che rende fattibile lo screening ad alto rendimento della chemioterapia13. La tecnica più comune utilizzata per i modelli zPDX si basa sulla digestione completa del campione e sull’impianto delle popolazioni cellulari primarie, che riproduce parzialmente il tumore, ma presenta gli svantaggi di una mancanza di microambiente tumorale e diafonia tra cellule maligne e sane14.
Questo lavoro mostra come gli zPDX possono essere utilizzati come modello preclinico per identificare il profilo di chemiosensibilità dei pazienti con cancro del pancreas. La preziosa strategia facilita il processo di xenotrapianto, poiché non è necessaria l’espansione cellulare, consentendo l’accelerazione dello screening chemioterapico. La forza del modello è che tutti i componenti del microambiente sono mantenuti come sono nel tessuto tumorale del paziente, perché, come è noto, il comportamento del tumore dipende dalla loro interazione15,16. Ciò è molto favorevole rispetto ai metodi alternativi in letteratura, in quanto è possibile preservare l’eterogeneità del tumore e contribuire a migliorare la prevedibilità dell’esito del trattamento e della recidiva in modo paziente-specifico, consentendo così al modello zPDX di essere utilizzato in studi co-clinici. Questo manoscritto descrive i passaggi coinvolti nella realizzazione del modello zPDX, iniziando con un pezzo di resezione del tumore del paziente e trattandolo per analizzare la risposta alla chemioterapia.
Protocol
Representative Results
Discussion
I modelli in vivo nella ricerca sul cancro forniscono strumenti inestimabili per comprendere la biologia del cancro e prevedere la risposta al trattamento del cancro. Attualmente sono disponibili diversi modelli in vivo , ad esempio animali geneticamente modificati (topi transgenici e knockout) o xenotrapianti derivati da pazienti da cellule primarie umane. Nonostante molte caratteristiche ottimali, ognuna ha varie limitazioni. In particolare, i suddetti modelli mancano di un modo affidabile per imitare…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Pisa (progetto 114/16). Gli autori ringraziano Raffaele Gaeta dell’Unità Operativa di Istopatologia dell’Azienda Ospedaliera Pisana per la selezione dei campioni di pazienti e il supporto patologico. Ringraziamo anche Alessia Galante per il supporto tecnico nelle sperimentazioni. Questo articolo è basato sul lavoro di COST Action TRANSPAN, CA21116, sostenuto da COST (European Cooperation in Science and Technology).
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
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