化学感受性試験のためのゼブラフィッシュ患者由来膵臓癌異種移植片の樹立
Summary
前臨床モデルは、がん生物学の知識を進歩させ、治療効果を予測することを目的としています。この論文では、腫瘍組織断片を用いたゼブラフィッシュベースの患者由来異種移植片(zPDX)の生成について説明します。zPDXを化学療法で治療し、その治療効果を移植組織の細胞アポトーシスに関して評価した。
Abstract
がんは世界中の主な死因の1つであり、多くの種類のがんの発生率は増加し続けています。スクリーニング、予防、治療の面で多くの進歩が見られました。しかし、がん患者の化学感受性プロファイルを予測する前臨床モデルはまだ不足しています。このギャップを埋めるために、 in vivo 患者由来の異種移植片モデルが開発され、検証されました。このモデルは、受精後2日目のゼブラフィッシュ (Danio rerio) 胚に基づいており、患者の手術標本から採取した腫瘍組織の異種移植片断片のレシピエントとして使用されました。
腫瘍の挙動および治療への反応を分析する上で重要である腫瘍微小環境を維持するために、生体試料が消化または分解されなかったことも注目に値する。このプロトコルは、原発性固形腫瘍外科的切除からゼブラフィッシュベースの患者由来異種移植片(zPDX)を確立するための方法を詳述しています。解剖病理学者によるスクリーニングの後、標本はメスの刃を使用して解剖されます。壊死組織、血管、または脂肪組織を取り除き、0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mmの断片に切り刻みます。
次に、断片を蛍光標識し、ゼブラフィッシュ胚の卵周囲腔に異種移植します。多数の胚を低コストで処理できるため、複数の抗がん剤に対するzPDXの化学療法感受性をハイスループットにin vivo で解析することができます。共焦点画像は、対照群と比較して化学療法治療によって誘発されるアポトーシスレベルを検出および定量するために日常的に取得されます。異種移植片の手順は、1日で完了することができ、共同臨床試験の治療スクリーニングを実施するための合理的な時間枠を提供するため、時間的に大きな利点があります。
Introduction
臨床がん研究の問題点の一つは、がんが単一の疾患ではなく、時間とともに進化する様々な疾患であり、腫瘍自体や患者の特性に応じて特定の治療が必要であることです1。したがって、課題は、がん治療の結果を早期に予測するための新しい個別化された戦略を特定するために、患者指向のがん研究に移行することです2。これは、膵管腺癌(PDAC)が治療が困難な癌と見なされ、5年生存率が11%であるため、特に重要です3。
診断の遅れ、急速な進行、効果的な治療法の欠如は、PDACの最も差し迫った臨床問題のままです。したがって、主な課題は、患者をモデル化し、個別化医療に沿った最も効果的な治療法を選択するためにクリニックで適用できるバイオマーカーを特定することです4,5,6。時が経つにつれて、がん疾患をモデル化するための新しいアプローチが提案されてきました:患者由来オルガノイド(PDO)およびヒト腫瘍組織の供給源に由来するマウス患者由来異種移植片(mPDX)。それらは、治療に対する反応と抵抗性、ならびに疾患の再発を研究するために疾患を再現するために使用されてきた7,8,9。
同様に、ゼブラフィッシュベースの患者由来異種移植片(zPDX)モデルへの関心は、そのユニークで有望な特性10のおかげで増加しており、癌研究のための迅速かつ低コストのツールを表しています11,12。zPDXモデルでは腫瘍サンプルサイズが小さいため、化学療法のハイスループットスクリーニングが可能です13。zPDXモデルに使用される最も一般的な手法は、完全なサンプル消化と初代細胞集団の移植に基づいており、腫瘍を部分的に再現しますが、腫瘍の微小環境の欠如と悪性細胞と健康な細胞の間のクロストークという欠点があります14。
この研究は、zPDXを前臨床モデルとして使用して、膵臓がん患者の化学感受性プロファイルを特定する方法を示しています。貴重な戦略は、細胞増殖の必要がないため、異種移植プロセスを促進し、化学療法スクリーニングの加速を可能にします。このモデルの強みは、よく知られているように、腫瘍の挙動はそれらの相互作用に依存するため、すべての微小環境成分が患者の癌組織内でそのまま維持されることです15,16。これは、腫瘍の不均一性を維持し、患者固有の方法で治療結果と再発の予測可能性を改善することに貢献し、zPDXモデルを共同臨床試験で使用できるようにするため、文献の代替方法よりも非常に有利です。この原稿では、zPDXモデルの作成に必要なステップを、患者の腫瘍切除から始めて治療し、化学療法に対する反応を分析する手順について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
がん研究におけるin vivoモデルは、がん生物学を理解し、がん治療反応を予測するための貴重なツールを提供します。現在、異なるin vivoモデル、例えば、遺伝子改変動物(トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウス)またはヒト初代細胞からの患者由来の異種移植片が利用可能である。多くの最適な機能にもかかわらず、それぞれにさまざまな制限があります。特に、前…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、フォンダツィオーネピサ(プロジェクト114/16)によって資金提供されました。著者らは、Azienda Ospedaliera Pisanaの組織病理学ユニットのRaffaele Gaeta氏に、患者サンプルの選択と病理学のサポートに感謝の意を表したい。また、実験における技術サポートを提供してくれたアレッシア・ガランテにも感謝します。この記事は、COST(欧州科学技術協力)の支援を受けたCOST Action TRANSPAN, CA21116の作業に基づいています。
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
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