Establecimiento de xenoinjertos derivados de pacientes con pez cebra de cáncer de páncreas para pruebas de quimiosensibilidad
Summary
Los modelos preclínicos tienen como objetivo avanzar en el conocimiento de la biología del cáncer y predecir la eficacia del tratamiento. Este artículo describe la generación de xenoinjertos derivados de pacientes a base de pez cebra (zPDX) con fragmentos de tejido tumoral. Las zPDX se trataron con quimioterapia, cuyo efecto terapéutico se evaluó en términos de apoptosis celular del tejido trasplantado.
Abstract
El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, y la incidencia de muchos tipos de cáncer sigue aumentando. Se ha avanzado mucho en términos de detección, prevención y tratamiento; Sin embargo, todavía faltan modelos preclínicos que predigan el perfil de quimiosensibilidad de los pacientes con cáncer. Para llenar este vacío, se desarrolló y validó un modelo de xenoinjerto derivado del paciente in vivo . El modelo se basó en embriones de pez cebra (Danio rerio) a los 2 días después de la fertilización, que se utilizaron como receptores de fragmentos de xenoinjerto de tejido tumoral tomados de la muestra quirúrgica de un paciente.
También vale la pena señalar que las muestras biópticas no fueron digeridas o desagregadas, con el fin de mantener el microambiente tumoral, lo cual es crucial en términos de analizar el comportamiento tumoral y la respuesta a la terapia. El protocolo detalla un método para establecer xenoinjertos derivados de pacientes (zPDX) a base de pez cebra a partir de la resección quirúrgica de tumor sólido primario. Después de la detección por un anatomopatólogo, la muestra se disecciona con una hoja de bisturí. El tejido necrótico, los vasos o el tejido graso se extraen y luego se cortan en trozos de 0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mm.
Las piezas se marcan con fluorescencia y se xenotrasplantan en el espacio perivitelino de los embriones de pez cebra. Se puede procesar un gran número de embriones a bajo costo, lo que permite análisis in vivo de alto rendimiento de la quimiosensibilidad de zPDX a múltiples medicamentos contra el cáncer. Las imágenes confocales se adquieren rutinariamente para detectar y cuantificar los niveles apoptóticos inducidos por el tratamiento de quimioterapia en comparación con el grupo control. El procedimiento de xenoinjerto tiene una ventaja de tiempo significativa, ya que se puede completar en un solo día, proporcionando una ventana de tiempo razonable para llevar a cabo un cribado terapéutico para ensayos coclínicos.
Introduction
Uno de los problemas de la investigación clínica del cáncer es que el cáncer no es una sola enfermedad, sino una variedad de enfermedades diferentes que pueden evolucionar con el tiempo, requiriendo tratamientos específicos dependiendo de las características del propio tumor y del paciente1. En consecuencia, el desafío es avanzar hacia la investigación oncológica orientada al paciente, con el fin de identificar nuevas estrategias personalizadas para la predicción temprana de los resultados del tratamiento del cáncer2. Esto es particularmente relevante para el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), ya que se considera un cáncer difícil de tratar, con una tasa de supervivencia a 5 años del 11%3.
El diagnóstico tardío, la progresión rápida y la falta de terapias efectivas siguen siendo los problemas clínicos más apremiantes de PDAC. El principal desafío es, por lo tanto, modelar al paciente e identificar biomarcadores que puedan ser aplicados en la clínica para seleccionar la terapia más efectiva en línea con la medicina personalizada 4,5,6. Con el tiempo, se han propuesto nuevos enfoques para modelar enfermedades cancerosas: organoides derivados del paciente (PDO) y xenoinjertos derivados de pacientes de ratón (mPDX) se originaron a partir de una fuente de tejido tumoral humano. Se han utilizado para reproducir la enfermedad para estudiar la respuesta y la resistencia a la terapia, así como la recurrencia de la enfermedad 7,8,9.
Del mismo modo, el interés en los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (zPDX) basados en pez cebra ha aumentado, gracias a sus características únicas y prometedoras10, lo que representa una herramienta rápida y de bajo costo para la investigación del cáncer11,12. Los modelos zPDX requieren solo un tamaño de muestra tumoral pequeño, lo que hace factible el cribado de quimioterapia de alto rendimiento13. La técnica más común utilizada para los modelos zPDX se basa en la digestión completa de la muestra y la implantación de las poblaciones de células primarias, que reproduce parcialmente el tumor, pero tiene las desventajas de la falta de microambiente tumoral y la diafonía entre células malignas y sanas14.
Este trabajo muestra cómo se pueden usar las zPDX como modelo preclínico para identificar el perfil de quimiosensibilidad de pacientes con cáncer de páncreas. La valiosa estrategia facilita el proceso de xenoinjerto, ya que no hay necesidad de expansión celular, lo que permite acelerar el cribado de quimioterapia. La fortaleza del modelo es que todos los componentes del microambiente se mantienen tal como están en el tejido canceroso del paciente, porque, como es bien sabido, el comportamiento del tumor depende de su interacción15,16. Esto es altamente favorable sobre los métodos alternativos en la literatura, ya que es posible preservar la heterogeneidad tumoral y contribuir a mejorar la previsibilidad del resultado del tratamiento y la recaída de una manera específica del paciente, lo que permite que el modelo zPDX se utilice en ensayos coclínicos. Este manuscrito describe los pasos involucrados en la elaboración del modelo zPDX, comenzando con una parte de la resección del tumor del paciente y tratándola para analizar la respuesta a la quimioterapia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los modelos in vivo en la investigación del cáncer proporcionan herramientas invaluables para comprender la biología del cáncer y predecir la respuesta al tratamiento del cáncer. Actualmente, se dispone de diferentes modelos in vivo , por ejemplo, animales modificados genéticamente (ratones transgénicos y knockout) o xenoinjertos derivados de pacientes a partir de células primarias humanas. A pesar de muchas características óptimas, cada una tiene varias limitaciones. En particular, los modelo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fondazione Pisa (proyecto 114/16). Los autores desean agradecer a Raffaele Gaeta de la Unidad de Histopatología de Azienda Ospedaliera Pisana por la selección de muestras de pacientes y el apoyo a la patología. También agradecemos a Alessia Galante por el apoyo técnico en los experimentos. Este artículo se basa en el trabajo de COST Action TRANSPAN, CA21116, apoyado por COST (Cooperación Europea en Ciencia y Tecnología).
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
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