Etablering av zebrafisk patient-derived xenografts från bukspottskörtelcancer för kemosensitivitetstestning
Summary
Prekliniska modeller syftar till att öka kunskapen om cancerbiologi och förutsäga behandlingseffekt. Denna artikel beskriver genereringen av zebrafiskbaserade patient-derived xenografts (zPDX) med tumörvävnadsfragment. ZPDX behandlades med kemoterapi, vars terapeutiska effekt bedömdes med avseende på cellapoptos av den transplanterade vävnaden.
Abstract
Cancer är en av de främsta dödsorsakerna i världen, och förekomsten av många typer av cancer fortsätter att öka. Stora framsteg har gjorts när det gäller screening, förebyggande och behandling. Prekliniska modeller som förutsäger kemosensitivitetsprofilen hos cancerpatienter saknas dock fortfarande. För att fylla detta gap utvecklades och validerades en in vivo patient-härledd xenograftmodell. Modellen baserades på zebrafiskembryon (Danio rerio) 2 dagar efter befruktning, som användes som mottagare av xenograftfragment av tumörvävnad som tagits från en patients kirurgiska prov.
Det är också värt att notera att bioptiska prover inte smältes eller disaggregerades för att upprätthålla tumörmikromiljön, vilket är avgörande när det gäller att analysera tumörbeteende och svaret på terapi. Protokollet beskriver en metod för att etablera zebrafiskbaserade patient-derived xenografts (zPDX) från primär solid tumörkirurgisk resektion. Efter screening av en anatomipatolog dissekeras provet med hjälp av ett skalpellblad. Nekrotisk vävnad, kärl eller fettvävnad avlägsnas och hackas sedan i 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm bitar.
Bitarna märks sedan fluorescerande och xenotransplanteras in i perivitellinutrymmet hos zebrafiskembryon. Ett stort antal embryon kan bearbetas till en låg kostnad, vilket möjliggör in vivo-analyser med hög genomströmning av zPDX: s kemosensitivitet för flera cancerläkemedel. Konfokala bilder förvärvas rutinmässigt för att detektera och kvantifiera de apoptotiska nivåerna inducerade av kemoterapibehandling jämfört med kontrollgruppen. Xenograft-proceduren har en betydande tidsfördel, eftersom den kan slutföras på en enda dag, vilket ger ett rimligt tidsfönster för att genomföra en terapeutisk screening för samkliniska prövningar.
Introduction
Ett av problemen med klinisk cancerforskning är att cancer inte är en enda sjukdom, utan en mängd olika sjukdomar som kan utvecklas över tiden, vilket kräver specifika behandlingar beroende på tumörens egenskaper och patienten1. Följaktligen är utmaningen att gå mot patientorienterad cancerforskning för att identifiera nya personliga strategier för tidig förutsägelse av cancerbehandlingsresultat2. Detta är särskilt relevant för pankreas duktalt adenokarcinom (PDAC), eftersom det anses vara en svårbehandlad cancer, med en 5-årig överlevnad på 11%3.
Den sena diagnosen, snabba utvecklingen och bristen på effektiva terapier är fortfarande de mest pressande kliniska problemen med PDAC. Den största utmaningen är därför att modellera patienten och identifiera biomarkörer som kan appliceras i kliniken för att välja den mest effektiva terapin i linje med personlig medicin 4,5,6. Med tiden har nya metoder föreslagits för att modellera cancersjukdomar: patient-derived organoids (PDOs) och muspatient-derived xenografts (mPDX) härstammar från en källa till human tumörvävnad. De har använts för att reproducera sjukdomen för att studera svaret och resistensen mot terapi, liksom sjukdomsåterfall 7,8,9.
På samma sätt har intresset för zebrafiskbaserade patient-derived xenograft (zPDX) modeller ökat, tack vare deras unika och lovande egenskaper10, som representerar ett snabbt och billigt verktyg för cancerforskning11,12. zPDX-modeller kräver endast en liten tumörprovstorlek, vilket gör screening av kemoterapi med hög genomströmning möjlig13. Den vanligaste tekniken som används för zPDX-modeller är baserad på fullständig provsmältning och implantation av de primära cellpopulationerna, som delvis reproducerar tumören, men har nackdelarna med brist på tumörmikromiljö och överhörning mellan maligna och friska celler14.
Detta arbete visar hur zPDX kan användas som en preklinisk modell för att identifiera kemosensitivitetsprofilen hos patienter med bukspottkörtelcancer. Den värdefulla strategin underlättar xenograftprocessen, eftersom det inte finns något behov av cellexpansion, vilket möjliggör acceleration av kemoterapiscreeningen. Modellens styrka är att alla mikromiljökomponenter bibehålls som de är i patientens cancervävnad, eftersom, som det är välkänt, tumörens beteende beror på deras samspel15,16. Detta är mycket gynnsamt jämfört med alternativa metoder i litteraturen, eftersom det är möjligt att bevara tumörheterogeniteten och bidra till att förbättra förutsägbarheten av behandlingsresultat och återfall på ett patientspecifikt sätt, vilket gör att zPDX-modellen kan användas i samkliniska prövningar. Detta manuskript beskriver stegen som är involverade i att göra zPDX-modellen, börjar med en bit av patientens tumörresektion och behandlar den för att analysera svaret på kemoterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo-modeller inom cancerforskning ger ovärderliga verktyg för att förstå cancerbiologi och förutsäga cancerbehandlingssvaret. För närvarande finns olika in vivo-modeller tillgängliga, till exempel genetiskt modifierade djur (transgena möss och knockoutmöss) eller patienthärledda xenotransplantat från humana primära celler. Trots många optimala funktioner har var och en olika begränsningar. I synnerhet saknar de ovannämnda modellerna ett tillförlitligt sätt att efterlikna patienten…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av Fondazione Pisa (projekt 114/16). Författarna vill tacka Raffaele Gaeta från histopatologiska enheten i Azienda Ospedaliera Pisana för patientprovvalet och patologistödet. Vi tackar också Alessia Galante för det tekniska stödet i experimenten. Denna artikel är baserad på arbete från COST Action TRANSPAN, CA21116, med stöd av COST (European Cooperation in Science and Technology).
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
References
- Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O’Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
