Mise en place de xénogreffes de poisson zèbre provenant de patients atteints d’un cancer du pancréas pour des tests de chimiosensibilité
Summary
Les modèles précliniques visent à faire progresser les connaissances sur la biologie du cancer et à prédire l’efficacité des traitements. Cet article décrit la génération de xénogreffes dérivées de patients (zPDX) à base de poisson zèbre avec des fragments de tissu tumoral. Les zPDX ont été traités par chimiothérapie, dont l’effet thérapeutique a été évalué en termes d’apoptose cellulaire du tissu transplanté.
Abstract
Le cancer est l’une des principales causes de décès dans le monde et l’incidence de nombreux types de cancer continue d’augmenter. Beaucoup de progrès ont été réalisés en termes de dépistage, de prévention et de traitement; Cependant, les modèles précliniques qui prédisent le profil de chimiosensibilité des patients atteints de cancer font encore défaut. Pour combler cette lacune, un modèle de xénogreffe in vivo dérivé de patients a été développé et validé. Le modèle était basé sur des embryons de poisson zèbre (Danio rerio) 2 jours après la fécondation, qui ont été utilisés comme receveurs de fragments de xénogreffe de tissu tumoral prélevés sur l’échantillon chirurgical d’un patient.
Il convient également de noter que les échantillons bioptiques n’ont pas été digérés ou désagrégés, afin de maintenir le microenvironnement tumoral, ce qui est crucial en termes d’analyse du comportement tumoral et de la réponse au traitement. Le protocole détaille une méthode pour établir des xénogreffes dérivées de patients (zPDX) à base de poisson zèbre à partir de la résection chirurgicale primaire de tumeur solide. Après criblage par un anatomopathologiste, le spécimen est disséqué à l’aide d’une lame de scalpel. Les tissus nécrotiques, les vaisseaux ou les tissus adipeux sont enlevés, puis coupés en morceaux de 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm.
Les morceaux sont ensuite marqués par fluorescence et xénotransplantés dans l’espace périvitellin des embryons de poisson zèbre. Un grand nombre d’embryons peuvent être traités à faible coût, ce qui permet des analyses in vivo à haut débit de la chimiosensibilité des zPDX à plusieurs médicaments anticancéreux. Des images confocales sont systématiquement acquises pour détecter et quantifier les niveaux apoptotiques induits par le traitement de chimiothérapie par rapport au groupe témoin. La procédure de xénogreffe présente un avantage de temps significatif, car elle peut être achevée en une seule journée, offrant une fenêtre de temps raisonnable pour effectuer un dépistage thérapeutique pour les essais cocliniques.
Introduction
L’un des problèmes de la recherche clinique sur le cancer est que le cancer n’est pas une maladie unique, mais une variété de maladies différentes qui peuvent évoluer au fil du temps, nécessitant des traitements spécifiques en fonction des caractéristiques de la tumeur elle-même et du patient1. Par conséquent, le défi consiste à s’orienter vers une recherche sur le cancer axée sur le patient, afin d’identifier de nouvelles stratégies personnalisées pour la prédiction précoce des résultats du traitement du cancer2. Ceci est particulièrement pertinent pour l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), car il est considéré comme un cancer difficile à traiter, avec un taux de survie à 5 ans de 11%3.
Le diagnostic tardif, la progression rapide et le manque de thérapies efficaces demeurent les problèmes cliniques les plus urgents de l’ACPE. Le principal défi est donc de modéliser le patient et d’identifier les biomarqueurs qui peuvent être appliqués en clinique pour sélectionner la thérapie la plus efficace en ligne avec la médecine personnalisée 4,5,6. Au fil du temps, de nouvelles approches ont été proposées pour modéliser les maladies cancéreuses : les organoïdes dérivés de patients (AOP) et les xénogreffes dérivées de souris (mPDX) provenaient d’une source de tissu tumoral humain. Ils ont été utilisés pour reproduire la maladie afin d’étudier la réponse et la résistance au traitement, ainsi que la récurrence de la maladie 7,8,9.
De même, l’intérêt pour les modèles de xénogreffe dérivée de patients (zPDX) à base de poisson zèbre a augmenté, grâce à leurs caractéristiques uniques et prometteuses10, représentant un outil rapide et peu coûteux pour la recherche sur le cancer11,12. Les modèles zPDX ne nécessitent qu’une petite taille d’échantillon tumoral, ce qui rend possible le dépistage à haut débit de la chimiothérapie13. La technique la plus couramment utilisée pour les modèles zPDX est basée sur la digestion complète de l’échantillon et l’implantation des populations cellulaires primaires, ce qui reproduit partiellement la tumeur, mais présente les inconvénients d’un manque de microenvironnement tumoral et de diaphonie entre cellules malignes et saines14.
Ce travail montre comment les zPDX peuvent être utilisés comme modèle préclinique pour identifier le profil de chimiosensibilité des patients atteints de cancer du pancréas. La stratégie précieuse facilite le processus de xénogreffe, car il n’y a pas besoin d’expansion cellulaire, ce qui permet d’accélérer le dépistage de la chimiothérapie. La force du modèle est que tous les composants du microenvironnement sont maintenus tels quels dans le tissu cancéreux du patient, car, comme on le sait, le comportement de la tumeur dépend de leur interaction15,16. Ceci est très favorable aux méthodes alternatives dans la littérature, car il est possible de préserver l’hétérogénéité tumorale et de contribuer à améliorer la prévisibilité du résultat du traitement et de la rechute d’une manière spécifique au patient, permettant ainsi au modèle zPDX d’être utilisé dans les essais cocliniques. Ce manuscrit décrit les étapes impliquées dans la fabrication du modèle zPDX, en commençant par un morceau de résection tumorale du patient et en le traitant pour analyser la réponse à la chimiothérapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les modèles in vivo dans la recherche sur le cancer fournissent des outils inestimables pour comprendre la biologie du cancer et prédire la réponse au traitement du cancer. Actuellement, différents modèles in vivo sont disponibles, par exemple, des animaux génétiquement modifiés (souris transgéniques et knockout) ou des xénogreffes dérivées de patients à partir de cellules primaires humaines. Malgré de nombreuses caractéristiques optimales, chacune a des limites différentes. En particuli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la Fondazione Pisa (projet 114/16). Les auteurs tiennent à remercier Raffaele Gaeta de l’unité d’histopathologie de l’Azienda Ospedaliera Pisana pour la sélection des échantillons de patients et le soutien en pathologie. Nous remercions également Alessia Galante pour le soutien technique dans les expériences. Cet article est basé sur les travaux de COST Action TRANSPAN, CA21116, soutenus par COST (Coopération européenne en science et technologie).
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
References
- Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O’Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
