Denne protokol har til formål at give detaljerede procedurer til indsamling, fiksering og vedligeholdelse af mycoheterotrofe planteprøver ved anvendelse af forskellige mikroskopiteknikker såsom scanning og transmissionselektronmikroskopi, lys-, konfokal og fluorescensmikroskopi for at studere svampekolonisering i plantevæv og frø spiret med mycorrhizal svampe.
Strukturel botanik er et uundværligt perspektiv for fuldt ud at forstå økologi, fysiologi, udvikling og udvikling af planter. Når man forsker i mycoheterotrofe planter (dvs. planter, der får kulstof fra svampe), kan bemærkelsesværdige aspekter af deres strukturelle tilpasninger, mønstre af vævskolonisering af svampe og underjordiske organers morfoanatomi oplyse deres udviklingsstrategier og deres forhold til hyfer, kilden til næringsstoffer. En anden vigtig rolle af symbiotiske svampe er relateret til spiring af orkidéfrø; alle Orchidaceae-arter er mycoheterotrofe under spiring og frøplantestadium (indledende mycoheterotrofi), selv dem, der fotosyntetiserer i voksne stadier. På grund af manglen på ernæringsmæssige reserver i orkidéfrø er svampesymbionter afgørende for at tilvejebringe substrater og muliggøre spiring. Analyse af spiringsstadier ved strukturelle perspektiver kan også besvare vigtige spørgsmål vedrørende svampeinteraktionen med frøene. Forskellige billeddannelsesteknikker kan anvendes til at afsløre svampeendofytter i plantevæv, som det foreslås i denne artikel. Frihånd og tynde sektioner af planteorganer kan farves og derefter observeres ved hjælp af lysmikroskopi. En fluorokrom, der er konjugeret til hvedekimagglutinin, kan påføres svampene og co-inkuberes med Calcofluor White for at fremhæve plantecellevægge i konfokal mikroskopi. Derudover er metoderne til scanning og transmissionselektronmikroskopi detaljeret for mycoheterotrofe orkideer, og mulighederne for at anvende sådanne protokoller i beslægtede planter undersøges. Symbiotisk spiring af orkidéfrø (dvs. i nærvær af mycorrhizal svampe) er beskrevet i protokollen detaljeret sammen med muligheder for at forberede strukturerne opnået fra forskellige spiringsstadier til analyser med lys-, konfokal og elektronmikroskopi.
Strukturel forskning i botanik, der dækker plantemorfologi og anatomi, er grundlæggende for at forstå hele organismen1,2 og giver uundværlige perspektiver til at integrere og bidrage til viden om økologi, fysiologi, udvikling og udvikling af planter3. Metoder inden for plantemorfologi og anatomi omfatter i øjeblikket protokoller, udstyr og viden, der er udviklet for nylig såvel som for mere end et århundrede siden2. Den kontinuerlige udførelse og tilpasning af klassiske metoder (f.eks. lysmikroskopi) sammen med nyere teknikker (f.eks. konfokal mikroskopi, røntgenmikrotomografi) har det samme væsentlige grundlag: teoretisk viden, der muliggør udvikling af en metode.
Det vigtigste værktøj i planteanatomi og morfologi er billedet. På trods af den misforståelse, at sådanne analyser er enkle observationer, der giver plads til subjektive fortolkninger2, kræver analyse og forståelse af billeder på dette område kendskab til de anvendte metoder (udstyr, analysetype, metodologiske procedurer), cellekomponenter, histokemi og plantekroppen (vævsorganisation og funktion, ontogeni, morfologiske tilpasninger). Fortolkning af de billeder, der er opnået via en række forskellige metoder, kan føre til korrelering af form og funktion, dechifrering af en strukturs kemiske sammensætning, bekræftelse af beskrivelse af taxa, forståelse af infektioner med fytopatogener og andre sådanne vurderinger.
Når man forsker i mycoheterotrofe (MH) planter (dvs. ikke-fotosyntetiske planter, der opnår kulstof fra mycorrhizal svampe4,5), kan bemærkelsesværdige aspekter af deres strukturelle tilpasninger, mønstre af vævskolonisering af svampe og underjordiske organers morfoanatomi oplyse deres udviklingsstrategier og forhold til hyfer, som er kilden til næringsstoffer. De underjordiske organer af MH-planter viser normalt vigtige tilpasninger relateret til deres tilknytning til jordsvampe, og det er derfor vigtigt at udføre disse anatomiske og morfologiske undersøgelser6. MH-arters luftorganer bør ikke ignoreres, da endofytter også kan være til stede i disse væv, selvom de ikke er mycorrhizal svampe (personlige observationer, ikke offentliggjort endnu).
Udover den veletablerede væsentlighed af mycorrhizal svampe tilknytning til MH-arter i hele deres livscyklus7, har hver orkidéart, selv de autotrofiske, et indledende obligatorisk mycoheterotrofisk stadium i naturlige miljøer. Det opstår, fordi orkideernes embryo er udifferentieret og mangler endosperm eller cotyledoner, hvilket er ude af stand til at udvikle sig og etablere sig i naturlige miljøer uden ernæringsmæssig støtte fra svampepartnere 4,8. I betragtning af at symbiotiske spiringsprotokoller ikke kun kan anvendes på MH-arter, men også på fotosyntetiserende orkideer, der sigter mod at undersøge orkidésvampspecificitet i spiring og protocormudvikling, en meget anvendt metode i initiativer til bevarelse af truede arter 9,10,11.
I denne metodesamling beskriver vi vigtige trin involveret i indsamling, fiksering og opbevaring af MH-planteprøver til anatomiske undersøgelser (afsnit 1), overfladeanalyse og prøveudvælgelse (afsnit 2), sektionsmetoder (frihånd: afsnit 3, mikrotomi: afsnit 4, kryomikrotomi: sektion 5), farvning og montering (afsnit 6), fluorescens og konfokal mikroskopi af svampeendofytter (afsnit 7), scanningselektronmikroskopi (afsnit 8), og transmissionselektronmikroskopi (afsnit 9). Derudover beskriver vi en symbiotisk spiringsmetode til orkidéfrø (MH og autotrofisk, afsnit 10), da de tidligere nævnte billeddannelsesmetoder med succes kan anvendes til at analysere svampekolonisering af frø, protocormer og frøplanter i spiringsprocessen.
Figur 1: Skematisk opsummering af billeddannelsesmetoder. Skemaerne giver indikationer af protokoltrin, hvor de er detaljerede. Forkortelser: GMA = glycolmethacrylat, OCT = optimal skæretemperaturforbindelse, SEM = scanningselektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
De mikroskopiteknikker, der er beskrevet her i detaljer (figur 1), indledes med følgende væsentlige trin: indsamling, fiksering, dehydrering, indlejring og sektionering af prøver. Da trinene er variable (figur 1) afhængigt af den eller de valgte teknikker, er det vigtigt at tænke fremad i betragtning af de fikseringsmidler, der skal fremstilles og transporteres til indsamlingsstedet, hvordan prøverne skal forberedes inden fastgørelse, de dehydreringsprocesser, der skal anvendes (afsnit 1), og forskellige indlejringsmuligheder og sektioneringsmetoder (afsnit 4, 5, og 9). Figur 1 opsummerer sekventielt alle de trin, der kræves for hver mikroskopiteknik, der er grundigt beskrevet nedenfor.
Billedanalyser i planteanatomi og morfologi har et vigtigt potentiale til at opfylde mål og hjælpe med at forstå forholdet mellem mycoheterotrofe planter og deres uundværlige svampeendofytter, som det fremgår af undersøgelser af underjordiske organer 6,40, strukturelle analyser af symbiotisk spiring af frø39 og luft- og reproduktionsstrukturer 41 . Strukturel botanik, på trods af at have mistet sin prestige …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker finansiering fra FAEPEX og FAPESP (2015/26479-6). MPP takker Capes for sit kandidatgradsstipendium (proces 88887.600591/2021-00) og CNPq. JLSM takker CNPq for produktivitetstilskud (303664/2020-7). Forfatterne takker også adgangen til udstyr og bistand fra LME (Laboratory of Electron Microscopy – IB / Unicamp), INFABiC (National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology – Unicamp) og LaBiVasc (Laboratory of Vascular Biology – DBEF / IB / Unicamp); LAMEB (UFSC) og Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) for bidrag til kryobeskyttelsesprotokollen LME for bidrag til TEM-protokollen.
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | (for SEM stubs mounting) |
Agar-agar (AA) | Sigma-Aldrich | A1296 | (for seeds germination tests) |
Calcofluor White Stain | Sigma-Aldrich | 18909 | fluorescent dye (detects cellulose) |
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8 | Sigma-Aldrich | C2488 | (for toluidine blue O staining) |
Conductive Double-Sided Carbon Tape | Fisher Scientific | 50-285-81 | (for SEM) |
Confocal Microscope | Zeiss | (any model) | |
Copper Grids | Sigma-Aldrich | G4776 | (for TEM) |
Critical-point dryer | Balzers | (any model) | |
Cryostat | Leica Biosystems | (any model) | |
Dissecting microscope | Leica Biosystems | (= stereomicroscope, any model) | |
Entellan | Sigma-Aldrich | 107960 | rapid mounting medium for microscopy |
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%) | Sigma-Aldrich | 459836 | (= ethanol, for dehydration processes) |
Formaldehyde solution, 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | (for NBF solution preparation) |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | histological tissue fixative |
Gelatin capsules for TEM | Fisher Scientific | 50-248-71 | (for resin polymerisation in TEM) |
Gelatin solution, 2% in H2O | Sigma-Aldrich | G1393 | (dilute for slides preparation – OCT adherence) |
Glutaraldehyde solution, 25% | Sigma-Aldrich | G6257 | (for Karnovsky’s solution preparation) |
HistoResin | Leica Biosystems | 14702231731 | glycol methacrylate (GMA) embedding kit |
Iodine | Sigma-Aldrich | 207772 | (for Lugol solution preparation) |
Lead(II) nitrate | Sigma-Aldrich | 228621 | Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining) |
Light Microscope | Olympus | (any model) | |
LR White acrylic resin | Sigma-Aldrich | L9774 | hydrophilic acrylic resin for TEM |
Lugol solution | Sigma-Aldrich | 62650 | (for staining) |
Metal stubs for specimen mounts | Rave Scientific | (for SEM, different models) | |
Microtome | Leica Biosystems | manual rotary microtome or other model | |
Oatmeal agar (OMA) | Millipore | O3506 | (for seeds germination tests) |
OCT Compound, Tissue-Tek | Sakura Finetek USA | 4583 | embedding medium for frozen tissues |
Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich | 201030 | OsO4 (for TEM postfixation) |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | sealing thermoplastic film |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | (for Karnovsky’s solution preparation) |
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O | Sigma-Aldrich | P8920 | (for slides preparation – OCT adherence) |
Poly-Prep Slides | Sigma-Aldrich | P0425 | poly-L-lysine coated glass slides |
Polyethylene Molding Cup Trays | Polysciences | 17177A-3 | (6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin) |
Polyethylene Molding Cup Trays | Polysciences | 17177C-3 | (13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin) |
Potassium iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | (for Lugol solution preparation) |
Potato Dextrose Agar (PDA) | Millipore | 70139 | (for seeds germination tests) |
Scanning Electron Microscope | Jeol | (any model) | |
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane] | Sigma-Aldrich | A3648 | (for slides preparation – OCT adherence) |
Silane-Prep Slides | Sigma-Aldrich | S4651 | glass slides coated with silane |
Silica gel orange, granular | Supelco | 10087 | (for dessicating processes) |
Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | C0250 | (for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer) |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining) |
Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | NaClO (for seeds surface disinfection) |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | 71640 | Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation) |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | NaH2PO4·H2O (for NBF and PB) |
Sputter coater | Balzers | (any model) | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | C12H22O11 (for cryoprotection and germination test) |
Sudan III | Sigma-Aldrich | S4131 | (for staining) |
Sudan IV | Sigma-Aldrich | 198102 | (for staining) |
Sudan Black B | Sigma-Aldrich | 199664 | (for staining) |
Syringe | (3 mL, any brand, for TEM contrast staining) | ||
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm | Millipore | SLGV033R | PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining) |
Tek Bond Super Glue 793 | Tek Bond Saint-Gobain | 78072720018 | liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity |
Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | (for staining) |
Transmission Electron Microscope | Jeol | (any model) | |
Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | T8877 | (for the tetrazolium test in seeds germination) |
Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining) |
Ultramicrotome | Leica Biosystems | (any model) | |
Uranyl acetate | Fisher Scientific | 18-607-645 | UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining) |
Vacuum pump | (any model) | ||
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | TermoFisher Scientific | W11261 | fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues) |