Techniques de microscopie pour interpréter la colonisation fongique dans les tissus végétaux mycohétérotrophes et germination symbiotique des graines

Summary

Ce protocole vise à fournir des procédures détaillées pour la collecte, la fixation et la conservation d’échantillons de plantes mycohétérotrophes, en appliquant différentes techniques de microscopie telles que la microscopie électronique à balayage et à transmission, la microscopie optique, confocale et à fluorescence pour étudier la colonisation fongique dans les tissus et les graines des plantes germées avec des champignons mycorhiziens.

Abstract

La botanique structurale est une perspective indispensable pour bien comprendre l’écologie, la physiologie, le développement et l’évolution des plantes. Lors de la recherche sur les plantes mycohétérotrophes (c’est-à-dire les plantes qui obtiennent du carbone des champignons), des aspects remarquables de leurs adaptations structurelles, les modèles de colonisation des tissus par les champignons et la morphoanatomie des organes souterrains peuvent éclairer leurs stratégies de développement et leurs relations avec les hyphes, la source de nutriments. Un autre rôle important des champignons symbiotiques est lié à la germination des graines d’orchidées; toutes les espèces d’Orchidaceae sont mycohétérotrophes pendant la germination et le stade des plantules (mycohétérotrophie initiale), même celles qui photosynthétisent à l’âge adulte. En raison du manque de réserves nutritionnelles dans les graines d’orchidées, les symbiotes fongiques sont essentiels pour fournir des substrats et permettre la germination. L’analyse des stades de germination par perspective structurelle peut également répondre à des questions importantes concernant l’interaction des champignons avec les graines. Différentes techniques d’imagerie peuvent être appliquées pour dévoiler des champignons endophytes dans les tissus végétaux, comme le proposent cet article. Des sections à main levée et minces d’organes végétaux peuvent être colorées puis observées à l’aide de la microscopie optique. Un fluorochrome conjugué à l’agglutinine de germe de blé peut être appliqué sur les champignons et co-incubé avec Calcofluor White pour mettre en évidence les parois cellulaires végétales en microscopie confocale. En outre, les méthodologies de microscopie électronique à balayage et à transmission sont détaillées pour les orchidées mycohétérotrophes, et les possibilités d’appliquer de tels protocoles dans des plantes apparentées sont explorées. La germination symbiotique des graines d’orchidées (c’est-à-dire en présence de champignons mycorhiziens) est décrite en détail dans le protocole, ainsi que les possibilités de préparer les structures obtenues à partir de différentes étapes de la germination pour des analyses par microscopie optique, confocale et électronique.

Introduction

La recherche structurale en botanique, couvrant la morphologie et l’anatomie des plantes, est fondamentale pour comprendre l’organisme entier^1,2, et fournit des perspectives indispensables pour intégrer et contribuer à la connaissance de l’écologie^, de la physiologie, du développement et de l’évolution des plantes³. Les méthodes en morphologie et anatomie des plantes comprennent actuellement des protocoles, des équipements et des connaissances développés récemment ainsi qu’il y a plus d’un siècle². L’exécution et l’adaptation continues de méthodes classiques (par exemple, la microscopie optique) ainsi que des techniques plus récentes (par exemple, la microscopie confocale, la microtomographie à rayons X) ont la même base essentielle: des connaissances théoriques permettant le développement d’une méthodologie.

L’outil principal en anatomie et morphologie des plantes est l’image. Malgré l’idée fausse que de telles analyses sont de simples observations, laissant place aux interprétations subjectives², l’analyse et la compréhension des images dans ce domaine nécessitent une connaissance des méthodes appliquées (équipement, type d’analyse, procédures méthodologiques), des composants cellulaires, de l’histochimie et du corps végétal (organisation et fonction tissulaire, ontogenèse, adaptations morphologiques). L’interprétation des images obtenues par diverses méthodes peut conduire à corréler la forme et la fonction, à déchiffrer la composition chimique d’une structure, à corroborer la description des taxons, à comprendre les infections par les phytopathogènes et à d’autres évaluations similaires.

Lors de la recherche sur les plantes mycohétérotrophes (MH) (c’est-à-dire les plantes non photosynthétiques qui obtiennent du carbone à partir de champignons mycorhiziens^4,5), des aspects remarquables de leurs adaptations structurelles, les modèles de colonisation des tissus par les champignons et la morphoanatomie des organes souterrains peuvent éclairer leurs stratégies de développement et leurs relations avec les hyphes^, qui sont la source de nutriments. Les organes souterrains des plantes MH présentent généralement des adaptations importantes liées à leur association avec les champignons du sol, il est donc essentiel d’effectuer ces investigations anatomiques et morphologiques⁶. Les organes aériens des espèces MH ne doivent pas être ignorés, car les endophytes peuvent également être présents dans ces tissus, même s’ils ne sont pas des champignons mycorhiziens (observations personnelles, pas encore publiées).

Outre l’essentialité bien établie de l’association des champignons mycorhiziens avec les espèces MH tout au long de leur cycle de vie⁷, toutes les espèces d’orchidées, même les autotrophes, ont un stade mycohétérotrophe obligatoire initial dans les milieux naturels. Elle se produit parce que l’embryon des orchidées est indifférencié et dépourvu d’endosperme ou de cotylédons, étant donc incapable de se développer et de s’établir dans des environnements naturels sans le soutien nutritionnel de partenaires fongiques ^4,8. Considérant que, les protocoles de germination symbiotique peuvent être appliqués non seulement aux espèces MH, mais aussi aux orchidées photosynthétiques, visant à étudier la spécificité orchidée-champignon dans la germination et le développement du protocorme, une méthodologie largement appliquée dans les initiatives de conservation des espèces menacées 9,10,11.

Dans cet assemblage de méthodes, nous décrivons les étapes importantes impliquées dans la collecte, la fixation et le stockage d’échantillons de plantes MH pour les études anatomiques (section 1), l’analyse de surface et la sélection des échantillons (section 2), les méthodes de sectionnement (à main levée: section 3, microtomie: section 4, cryomicrotomie: section 5), coloration et montage (section 6), la fluorescence et la microscopie confocale des endophytes fongiques (section 7), la microscopie électronique à balayage (section 8), et la microscopie électronique à transmission (section 9). De plus, nous décrivons une méthode de germination symbiotique pour les graines d’orchidées (MH et autotrophe, section 10), car les méthodes d’imagerie mentionnées précédemment peuvent être appliquées avec succès pour analyser la colonisation fongique des graines, des protocormes et des plantules dans le processus de germination.

Figure 1 : Résumé schématique des méthodes d’imagerie. Les schémas fournissent des indications sur les étapes du protocole dans lesquelles ils sont détaillés. Abréviations : GMA = méthacrylate de glycol, OCT = composé à température de coupe optimale, MEB = microscopie électronique à balayage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les techniques de microscopie décrites ici en détail (Figure 1) sont précédées des étapes essentielles suivantes : prélèvement, fixation, déshydratation, enrobage et sectionnement des échantillons. Comme les étapes sont variables (figure 1) en fonction de la ou des techniques choisies, il est important de penser à l’avenir, en tenant compte des fixateurs à préparer et à transporter vers le site de prélèvement, de la façon dont les échantillons doivent être préparés avant la fixation, des processus de déshydratation à utiliser (section 1), des différentes possibilités d’encastrement et des méthodes de sectionnement (sections 4, 5, et 9). La figure 1 résume séquentiellement toutes les étapes requises pour chaque technique de microscopie décrite en détail ci-dessous.

Protocol

1. Collecte, fixation et conservation des échantillons NOTE: Les plantes entièrement MH peuvent généralement être trouvées dans le sous-étage de la forêt sombre 12,13, principalement dans les zones humides et abondantes en litière, tandis que les plantes partiellement MH peuvent être trouvées dans les forêts plus ouvertes12,13. Les plantes MH ont gén…

Representative Results

Suivre les étapes essentielles de la fixation des tissus végétaux donne des structures cellulaires aussi proches que possible de l’état vivant, compte tenu de la morphologie, du volume et de l’organisation spatiale des composants cellulaires et des tissus16. Observer de tels traits dans les échantillons après fixation chimique (Figure 4). La figure 4C-F représente des échantillons correctement…

Discussion

Les analyses d’images en anatomie et morphologie des plantes ont un potentiel important pour atteindre les objectifs et aider à comprendre les relations entre les plantes mycohétérotrophes et leurs endophytes fongiques indispensables, comme le démontrent les études sur les organes souterrains^6,40, les analyses structurelles de la germination symbiotique des graines³⁹ et les structures aériennes et reproductrices ⁴¹<sup class="xref"…

Materials

Acetone	Sigma-Aldrich	179124	(for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape	Fisher Scientific	50-285-81	(for SEM)
Confocal Microscope	Zeiss		(any model)
Copper Grids	Sigma-Aldrich	G4776	(for TEM)
Critical-point dryer	Balzers		(any model)
Cryostat	Leica Biosystems		(any model)
Dissecting microscope	Leica Biosystems		(= stereomicroscope, any model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(dilute for slides preparation – OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine	Sigma-Aldrich	207772	(for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope	Olympus		(any model)
LR White acrylic resin	Sigma-Aldrich	L9774	hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution	Sigma-Aldrich	62650	(for staining)
Metal stubs for specimen mounts	Rave Scientific		(for SEM, different models)
Microtome	Leica Biosystems		manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA)	Millipore	O3506	(for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	(for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(for slides preparation – OCT adherence)
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425	poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide	Sigma-Aldrich	221945	(for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA)	Millipore	70139	(for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope	Jeol		(any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]	Sigma-Aldrich	A3648	(for slides preparation – OCT adherence)
Silane-Prep Slides	Sigma-Aldrich	S4651	glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular	Supelco	10087	(for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater	Balzers		(any model)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(for staining)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(for staining)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(for staining)
Syringe			(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(for staining)
Transmission Electron Microscope	Jeol		(any model)
Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877	(for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome	Leica Biosystems		(any model)
Uranyl acetate	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump			(any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)