Imagerie confocale et super-résolution du trafic intracellulaire polarisé et de la sécrétion de protéines de la membrane basale au cours de l’oogenèse de la drosophile

Summary

La membrane basale est essentielle à la morphogenèse des tissus et des organes pendant le développement. Pour mieux comprendre les mécanismes conduisant à un placement correct de cette structure, le protocole présenté décrit des méthodes pour visualiser et caractériser le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines de la membrane basale dans les cellules épithéliales en utilisant la microscopie confocale et super-résolution.

Abstract

La membrane basale (BM) – une feuille spécialisée de matrice extracellulaire présente du côté basal des cellules épithéliales – est essentielle à l’établissement et au maintien de la morphologie des tissus épithéliaux et de la morphogenèse des organes. De plus, le BM est essentiel pour la modélisation des tissus, servant de plate-forme de signalisation et fournissant des forces externes pour façonner les tissus et les organes. Malgré les nombreux rôles importants que joue le BM au cours du développement normal et des conditions pathologiques, les voies biologiques contrôlant le trafic intracellulaire des vésicules contenant du BM et la façon dont la sécrétion basale conduit au dépôt polarisé de protéines BM sont mal comprises. L’épithélium folliculaire de l’ovaire de la drosophile est un excellent système modèle pour étudier le dépôt basal des protéines membranaires BM, car il produit et sécrète tous les principaux composants du BM. L’imagerie confocale et super-résolution combinée au traitement d’images dans des tissus fixes permet l’identification et la caractérisation des facteurs cellulaires spécifiquement impliqués dans le trafic intracellulaire et le dépôt de protéines BM. Cet article présente un protocole détaillé pour la coloration et l’imagerie des vésicules contenant du BM et du BM déposé à l’aide de protéines marquées de manière endogène dans l’épithélium folliculaire de l’ovaire de la drosophile . Ce protocole peut être appliqué pour répondre à des questions qualitatives et quantitatives et il a été développé pour permettre un criblage à haut débit, permettant l’identification rapide et efficace des facteurs impliqués dans le trafic intracellulaire polarisé et la sécrétion de vésicules pendant le développement du tissu épithélial.

Introduction

La membrane basale (BM) est une fine feuille de matrice extracellulaire adhérente aux cellules (ECM) en couches essentielle à la structure épithéliale et à la morphogenèse¹. Il comprend environ 50 protéines et se trouve partout sous-jacent aux cellules épithéliales et endothéliales, ainsi qu’aux cellules squelettiques, lisses et cardiaques et aux adipocytes ^1,2,3. Les trois principaux composants du BM du côté basal des cellules épithéliales sont le collagène IV, le perlécan et les laminines. Le BM sous-tend les cellules épithéliales et est responsable de nombreuses fonctions, y compris la séparation et la barrière tissulaires, la croissance et le soutien, et la polarisation cellulaire ^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Son rôle en tant que plate-forme de signalisation régule la morphologie et la différenciation des cellules et tissus épithéliaux au cours du développement ^3,13,14. De plus, la mauvaise régulation du BM et/ou une atteinte à son intégrité sont les principales causes de nombreuses affections pathologiques, notamment les métastases tumorales ^2,15,16. Malgré les fonctions essentielles exercées par le BM lors de la morphogenèse des tissus et des organes, les composants de la ou des voies biologiques dédiées au trafic intracellulaire polarisé et à la sécrétion de protéines BM sont vaguement connus.

Pour étudier le trafic intracellulaire des vésicules contenant du BM et la sécrétion de protéines BM par les cellules épithéliales, l’épithélium folliculaire (FE) de l’ovaire de la drosophile est un puissant système modèle (Figure 1). Un ovaire de drosophile comprend 16 à 20 longues structures tubulaires, appelées ovarioles (Figure 1A,B)17,18,19. Chaque ovariole peut être considérée comme une chaîne d’assemblage d’œufs, avec la progression de l’âge des chambres d’œufs (qui donnent chacune naissance à un œuf) qui commence à l’extrémité antérieure et se déplace postérieurement, jusqu’à ce que l’œuf mature sorte par l’oviducte. Chaque chambre à œufs est encapsulée par le FE, une monocouche de cellules folliculaires somatiques (FC), qui entoure les cellules germinales centrales (GC). Le FE est fortement polarisé avec une polarité apicale-basale distincte où le domaine apical fait face à la lignée germinale, et les protéines BM sont sécrétées à la base^18,19. Les FC sécrètent activement tous les principaux composants du BM, y compris le collagène IV, le perlécan et les laminines^20,21. Dans les cellules épithéliales telles que les FC, les composants BM sont produits et nécessitent une voie de sécrétion polarisée spécialisée pour leur dépôt extracellulaire. Par exemple, dans le cas du composant le plus abondant du BM, le collagène IV (Coll IV), les détails entourant son trafic intracellulaire polarisé et sa sécrétion sont vagues bien que sa production et son dépôt fassent l’objet de nombreuses études. Coll IV est traduit dans le réticulum endoplasmique (RE), où chaque fibrille – composée de trois polypeptides (deux chaînes α1 et une chaîne α2) – est assemblée en une triple hélice²². Le repliement et le fonctionnement appropriés de Coll IV nécessitent des chaperons et des enzymes ER, y compris des lysyl et des prolyl-hydroxylases telles que Plod et PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Ces enzymes post-traductionnelles régulent le tri ER de Coll IV, car la perte de chacune provoque le piégeage de Coll IV dans l’ER basal 20,23,24,25,26. Ensuite, coll IV nouvellement synthétisé sort de l’urgence pour le Golgi dans des vésicules enrobées de COPII. Le récepteur de cargaison Tango1 aide à emballer les collagènes dans d’importantes vésicules liées à Golgi qui peuvent accueillir^de grandes protéines multimériques ^20,27. Une fois que Coll IV est emballé dans des vésicules exocytaires intracellulaires, il est spécifiquement sécrété par voie basale à partir de cellules épithéliales. Pour diriger le dépôt de BM vers le côté basal, les cellules épithéliales ont besoin d’un autre ensemble de facteurs spécifiquement dédiés à la sécrétion de BM polarisée. En utilisant l’EF de l’ovaire de la drosophile, quelques composants de ce nouveau processus cellulaire ont été caractérisés, y compris les facteurs d’échange de nucléotides (GEF) Crag et Stratum, les GTPases Rab8 et Rab10, ainsi que les niveaux de phosphoinositide PI(4,5)P2 et de protéines motrices Kinesin 1 et 3 20,28,29,30,31 . Ces composants sont essentiels pour assurer la distribution polarisée des protéines BM.

Pour surveiller la localisation intracellulaire des protéines BM dans la FE, des protéines de membrane basale marquées de manière endogène (pièges à protéines), telles que Viking-GFP (Vkg-GFP ou α2 Coll IV-GFP) et Perlecan-GFP (Pcan-GFP) peuvent être utilisées^32,33. Il a été démontré que ces lignées de pièges protéiques reflètent avec précision la distribution endogène des protéines BM et permettent une détection plus sensible du trafic^{vésiculeux 28,30}. Les composants impliqués dans le dépôt polarisé de BM dans le FE ont d’abord été caractérisés à l’aide de raies pièges protéiques pour Vkg-GFP et Pcan-GFP ^20,28,29,30. Les pièges à protéines peuvent être utilisés dans différents contextes génétiques, y compris les mutants et les lignées Gal4 ³⁴. De plus, les pièges à protéines peuvent être utilisés en combinaison avec des colorants fluorescents et/ou une immunocoloration par fluorescence, ce qui permet une caractérisation précise de la localisation des protéines BM lors de la comparaison des conditions de type sauvage et mutantes³⁵.

Pour évaluer avec précision et efficacité la distribution et la localisation des vésicules contenant des protéines BM, la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et les techniques d’imagerie à super-résolution présentent un avantage significatif par rapport aux autres approches d’imagerie. Ces approches associent l’imagerie haute résolution à une relative facilité d’utilisation. CLSM est une technique de microscopie qui permet d’améliorer la résolution optique en scannant l’échantillon avec un laser de manière raster à l’aide de galvanomètres. L’ouverture du sténopé est un composant central d’un microscope confocal. En bloquant les signaux flous provenant d’au-dessus ou au-dessous du plan focal, l’ouverture du sténopé se traduit par une résolution très supérieure dans l’axe z³⁶. Cela permet également d’obtenir une série d’images dans le plan z, appelée z-stack, correspondant à une série de sections optiques. z-stacks crée ensuite une image 3D du spécimen, via une reconstruction 3D, à l’aide d’un logiciel d’imagerie. Les microscopes à épifluorescence conventionnels (grand champ), contrairement aux microscopes confocaux, permettent à la lumière floue de contribuer à la qualité de l’image, en diminuant la résolution de l’image et le contraste^36,37. Cela fait de la microscopie à épifluorescence un candidat moins attrayant lors de l’étude de la localisation ou de la colocalisation des protéines.

Bien que le CLSM soit une approche appropriée pour diverses applications, y compris l’imagerie et la caractérisation du trafic intracellulaire des protéines BM, il présente toujours un problème lors de l’imagerie d’échantillons en dessous de la limite de diffraction de la lumière d’Abbe (200-250 nm). Lors de l’imagerie de tels échantillons, la microscopie confocale, en particulier lors de l’utilisation d’un objectif d’huile, peut entraîner une haute résolution. Cependant, les techniques de super-résolution dépassent la limite de la microscopie confocale. Il existe différentes approches pour obtenir une microscopie à super-résolution, chacune avec des limites de résolution spécifiques, et chacune appropriée pour différentes analyses. Ces approches comprennent la microscopie de localisation photoactivée (PALM) ou la microscopie à reconstruction optique stochastique (STORM), la microscopie à épuisement par émission stimulée (STED), la microscopie à éclairage structuré (SIM) et la microscopie Airyscan (super-résolution) ^{38,39,40,41,42,43,44,45,46} . Bien qu’Airyscan ait une résolution plus grossière que PALM/STORM, STED et SIM, il peut toujours atteindre une résolution allant jusqu’à ~ 120 nm (environ deux fois la résolution de CLSM). En outre, il a été démontré que cette approche de microscopie à super-résolution présente un avantage sur la carte SIM et d’autres techniques de super-résolution lors de l’imagerie d’échantillons épais et d’échantillons avec un faible rapport signal/bruit^47,48.

Airyscan est une technologie de microscopie confocale à super-résolution relativement nouvelle⁴⁶. Contrairement aux CLSM traditionnels, qui utilisent les détecteurs sténopé et monopoint pour rejeter la lumière floue, cette approche à super-résolution utilise un détecteur de zone de tube photomultiplicateur à 32 canaux de phosphure d’arséniure de gallium (GaAsP) qui recueille toute la lumière à chaque position de balayage⁴⁵. Chacun des 32 détecteurs fonctionne comme un petit sténopé, réduisant la taille du sténopé de l’unité aérée (A.U.) traditionnelle de 1,0 à une unité d’AIR améliorée de 0,2 A.U., permettant une résolution et un rapport signal/bruit encore plus élevés, tout en maintenant l’efficacité d’un diamètre de 1,25 A.U.^{de 45}. De plus, la déconvolution linéaire utilisée par Airyscan se traduit par une augmentation jusqu’à 2 fois de la résolution⁴⁵. Compte tenu de cela, clSM, et en particulier la microscopie à super-résolution, sont bien adaptés pour étudier les protéines BM et les protéines qui régulent le dépôt basal des protéines BM, car ils peuvent produire des images à très haute résolution pour les études de localisation et de colocalisation, fournissant ainsi de nouvelles informations sur les événements spatiaux, temporels et moléculaires qui contrôlent ces processus.

Une autre approche de la microscopie confocale qui peut être utilisée pour effectuer des expériences de localisation est la déconvolution d’image. Étant donné que la microscopie à grand champ permet à la lumière floue d’atteindre les détecteurs, des algorithmes de déconvolution mathématiques et informatiques peuvent être appliqués pour supprimer ou réaffecter la lumière floue des images obtenues par microscopie à grand champ, améliorant ainsi la résolution et le contraste de l’image⁴⁹. Les algorithmes de déconvolution peuvent également être appliqués aux images confocales pour augmenter encore la résolution et le contraste, produisant des images finales presque comparables à celles de la microscopie à super-résolution⁵⁰. Airyscan utilise la déconvolution basée sur les filtres Weiner ainsi que la réaffectation des pixels de Sheppard, ce qui se traduit par une résolution spatiale et un rapport signal/bruit considérablement améliorés. Par rapport à la microscopie confocale, une augmentation de 2x de la résolution dans les trois dimensions spatiales (120 nm en x et y, et 350 nm en z) est observée lors de l’utilisation de cette technique de microscopie à super-résolution^45,51.

Ce manuscrit fournit des protocoles détaillés et optimisés pour colorer, acquérir et visualiser le trafic intracellulaire et le dépôt de protéines BM en utilisant l’EF de l’ovaire de la drosophile comme système modèle couplé à la microscopie confocale et à super-résolution. Les lignées de drosophiles exprimant des protéines de membrane basale marquées de manière endogène, par exemple Vkg-GFP et Pcan-GFP, sont des outils efficaces et précis pour visualiser le trafic et la sécrétion de protéines BM. En outre, ils peuvent être facilement utilisés dans différents contextes génétiques, y compris les lignées mutantes et Gal4 / UAS ³⁴. Bien que les protéines de la membrane basale marquées de manière endogène soient recommandées, l’utilisation d’anticorps contre des protéines BM spécifiques est également compatible avec les protocoles décrits. Ces protocoles sont particulièrement utiles pour les scientifiques qui s’intéressent à l’étude du trafic intracellulaire et de la sécrétion de protéines BM dans les tissus épithéliaux intacts à l’aide de l’imagerie confocale et à super-résolution. De plus, la capacité de combiner l’analyse des tissus épithéliaux avec les outils étendus de la génétique de la drosophile rend cette approche particulièrement puissante. Enfin, ces protocoles pourraient être facilement adaptés pour étudier le trafic vésiculeux et le tri d’autres protéines d’intérêt.

Protocol

1. Préparation des mouches pour les dissections ovariennes Mettez 10-15 mouches femelles Drosophila melanogaster (âgées de 1 à 2 jours) du génotype souhaité dans un flacon étroit contenant environ 8 mL de milieu de mouche drosophila saupoudré d’une petite quantité de levure de boulanger granulée 2-3 jours avant la dissection à 25 ° C. L’ajout de quelques mâles au flacon peut augmenter le rendement de la chambre à œufs. Cependant, assurez-vous que le nombre …

Representative Results

Les méthodes décrites ici peuvent être utilisées pour imager et caractériser efficacement et avec précision le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines BM dans les cellules épithéliales polarisées, telles que la FE de l’ovaire de la drosophile . Ensuite, nous fournissons les résultats anticipés obtenus à l’aide des méthodes décrites, ainsi que des conseils utiles et des pièges potentiels. Pour ce faire, Vkg-GFP, un Vkg marqué de manière endogène (Drosophila Col IV) es…

Discussion

Le BM est essentiel pour la morphogenèse embryonnaire et organique, et les fonctions physiologiques adultes. De plus, le BM agit comme une plate-forme de signalisation pour l’établissement et le maintien de la polarité épithéliale et fournit aux tissus un support². Pourtant, les mécanismes qui régulent le bon placement des protéines BM sont mal compris. Une meilleure compréhension des voies biologiques dédiées au trafic intracellulaire et à la sécrétion polarisée des protéines BM…

Materials

Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing