Confocal og Super-Resolution Imaging av polarisert intracellulær smugling og sekresjon av kjellermembranproteiner under Drosophila Oogenese

Summary

Kjellermembranen er avgjørende for vev og organmorfogenese under utvikling. For bedre å forstå mekanismene som fører til riktig plassering av denne strukturen, beskriver protokollen som presenteres metoder for å visualisere og karakterisere intracellulær smugling og sekresjon av kjellermembranproteiner i epitelceller ved hjelp av konfomisk og superoppløselig mikroskopi.

Abstract

Kjellermembranen (BM) – et spesialisert ark med ekstracellulær matrise tilstede på basalsiden av epitelceller – er avgjørende for etablering og vedlikehold av epitelvevmorfologi og organmorfogenese. Videre er BM avgjørende for vevsmodellering, som fungerer som en signalplattform, og gir eksterne krefter til å forme vev og organer. Til tross for de mange viktige rollene som BM spiller under normal utvikling og patologiske forhold, er de biologiske veiene som kontrollerer den intracellulære smuglingen av BM-inneholdende vesikler og hvordan basal sekresjon fører til polarisert avsetning av BM-proteiner dårlig forstått. Follikulær epitel av Drosophila eggstokken er et utmerket modellsystem for å studere basal avsetning av BM membran proteiner, som det produserer og utskiller alle viktige komponenter i BM. Confocal og super-oppløsning avbildning kombinert med bildebehandling i faste vev gjør det mulig å identifisere og karakterisere cellulære faktorer spesielt involvert i intracellulær trafficking og avsetning av BM proteiner. Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for farging og avbildning av BM-inneholdende vesicles og avsatt BM ved hjelp av endogenet merkede proteiner i follikulær epitel av Drosophila eggstokken. Denne protokollen kan brukes til å håndtere både kvalitative og kvantitative spørsmål, og den ble utviklet for å imøtekomme screening med høy gjennomstrømning, noe som muliggjør rask og effektiv identifisering av faktorer som er involvert i polarisert intracellulær smugling og sekresjon av vesikler under epitelvevsutvikling.

Introduction

Kjellermembranen (BM) er et tynt ark med lagdelt celletilknyttet ekstracellulær matrise (ECM) som er kritisk for epitelstruktur og morfogenese¹. Den består av ~ 50 proteiner og finnes allestedsnærværende underliggende epitel- og endotelceller, og omkranser skjelett-, glatt- og hjertemuskelceller og adipocytter ^1,2,3. De tre hovedkomponentene i BM på basalsiden av epitelcellene er Kollagen IV, Perlecan og Laminins. BM ligger til grunn for epitelcellene og er ansvarlig for mange funksjoner, inkludert vevsseparasjon og barriere, vekst og støtte, og cellepolarisering 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Dens rolle som signalplattform regulerer morfologi og differensiering av epitelceller og vev under utvikling ^3,13,14. Videre er feilregulering av BM og / eller et brudd i integriteten hovedårsakene til mange patologiske forhold, inkludert tumormetastase ^2,15,16. Til tross for de essensielle funksjonene som utføres av BM under vev og organmorfogenese, er komponentene i de biologiske banene dedikert til polarisert intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner vagt kjent.

For å studere intracellulær smugling av BM-inneholdende vesikler og sekresjon av BM-proteiner ved epitelceller, er follikulær epitel (FE) av Drosophila eggstokken et kraftig modellsystem (figur 1). En Drosophila eggstokk består av 16-20 lange, rørlignende strukturer, kalt ovarioles (Figur 1A, B) 17,18,19. Hver ovariol kan betraktes som en eggmonteringslinje, med aldersprogresjonen av eggkamre (som hver gir opphav til et egg) som begynner i den fremre enden og beveger seg bakre, til det modne egget kommer ut gjennom ovidukten. Hvert eggkammer er innkapslet av FE, en monolayer av somatiske follikkelceller (FCs), som omgir de sentrale bakteriecellene (GCs). FE er svært polarisert med en distinkt apikal-basal polaritet der det apikale domenet vender mot bakterien, og BM-proteinene utskilles basalt ^18,19. FCene skiller aktivt ut alle hovedkomponentene i BM, inkludert Collagen IV, Perlecan og Laminins^20,21. I epitelceller som FCs produseres BM-komponentene og krever en spesialisert polarisert sekresjonsvei for deres avsetning ekstracellulært. For eksempel, når det gjelder den mest tallrike komponenten i BM, Collagen IV (Coll IV), er detaljene rundt polarisert intracellulær smugling og sekresjon vage til tross for at produksjonen og avsetningen er fokus for mange studier. Coll IV er oversatt i endoplasmic retikulum (ER), som også er der hver fibril – sammensatt av tre polypeptider (to α1 kjeder og en α2 kjede) – er samlet i en trippel helix²². Riktig Coll IV folding og funksjon krever ER anstander og enzymer, inkludert lysyl og prolyl-hydroksylaser som Plod og PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Disse posttranslasjonelle enzymene regulerer ER-sorteringen av Coll IV, da tapet av hver fører til at Coll IV blir fanget i basal ER 20,23,24,25,26. Deretter avslutter nysyntetisert Coll IV ER for Golgi i COPII-belagte vesikler. Lastreseptoren Tango1 hjelper til med å pakke kollagener i betydelige Golgi-bundet vesicles som kan romme store multimeriske proteiner^20,27. Når Coll IV er pakket inn i intracellulære eksokytiske vesicles, utskilles det spesielt basalt fra epitelceller. For å lede BM-avsetning til basalsiden krever epitelceller et annet sett med faktorer spesielt dedikert til polarisert BM-sekresjon. Ved hjelp av FE av Drosophila eggstokken, noen få komponenter i denne nye cellulære prosessen har blitt karakterisert, inkludert nukleotidutvekslingsfaktorene (GEFs) Crag og Stratum, GTPases Rab8 og Rab10, samt nivåene av fosfoinositide PI(4,5)P2 og Kinesin 1 og 3 motorproteiner 20,28,29,30,31 . Disse komponentene er avgjørende for å sikre polarisert fordeling av BM-proteiner.

For å overvåke intracellulær lokalisering av BM-proteiner i FE, kan endogene merkede kjellermembranproteiner (proteinfeller), som Viking-GFP (Vkg-GFP eller α2 Coll IV-GFP) og Perlecan-GFP (Pcan-GFP) brukes^32,33. Disse proteinfellelinjene har vist seg å nøyaktig gjenspeile den endogene fordelingen av BM-proteiner og muliggjøre mer sensitiv deteksjon av bilikulær^{menneskehandel 28,30}. Komponentene som var involvert i polarisert avsetning av BM i FE ble først karakterisert ved hjelp av proteinfellelinjer for Vkg-GFP og Pcan-GFP 20,28,29,30. Proteinfeller kan brukes i forskjellige genetiske bakgrunner, inkludert mutanter og Gal4-linjer ³⁴. Videre kan proteinfeller brukes i kombinasjon med fluorescerende fargestoffer og / eller fluorescensimmunisering, noe som muliggjør presis karakterisering av lokalisering av BM-proteiner når man sammenligner villtype og mutantforhold³⁵.

For å nøyaktig og effektivt vurdere distribusjon og lokalisering av BM proteinholdige vesikler, konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM) og super-oppløsning bildebehandling teknikker utgjør en betydelig fordel for andre bildebehandling tilnærminger. Disse tilnærmingene kombinerer bildebehandling med høy oppløsning med relativt brukervennlighet. CLSM er en mikroskopiteknikk som muliggjør en forbedret optisk oppløsning ved å skanne prøven med en laser på en rasterskanning ved hjelp av galvanisometere. Pinhole blenderåpningen er en kjernekomponent i et konfokalt mikroskop. Ved å blokkere signalene som kommer ovenfra eller under brennplanet, resulterer pinhole-blenderåpningen i en svært overlegen oppløsning i z-aksen³⁶. Dette gjør det også mulig å få en serie bilder i z-planet, kalt en z-stack, som tilsvarer en rekke optiske seksjoner. z-stabler lager deretter et 3D-bilde av prøven, via 3D-rekonstruksjon, ved hjelp av bildeprogramvare. Konvensjonelle epifluorescence (widefield) mikroskoper, i motsetning til konfektmikroskoper, gjør det mulig for lyset utenfor fokus å bidra til bildekvalitet, redusert bildeoppløsning og kontrast^36,37. Dette gjør epifluorescensmikroskopi til en mindre attraktiv kandidat når man studerer proteinlokalisering eller colokalisering.

Selv om CLSM er en passende tilnærming for ulike bruksområder, inkludert avbildning og karakterisering av intracellulær smugling av BM-proteiner, presenterer den fortsatt et problem når man ser for seg prøver under Abbes diffraksjonsgrense for lys (200-250 nm). Ved avbildning av slike prøver kan konfektmikroskopi, spesielt når du bruker et oljemål, føre til høy oppløsning. Imidlertid overgår superoppløsningsteknikker grensen for konfektmikroskopi. Det finnes ulike tilnærminger for å oppnå mikroskopi med superoppløsning, hver med spesifikke oppløsningsgrenser, og hver egnet for ulike analyser. Disse tilnærmingene inkluderer fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM), stimulert utslippsnedbrytningsmikroskopi (STED), strukturert belysningsmikroskopi (SIM) og Airyscan (superoppløsning) mikroskopi 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Selv om Airyscan har en grovere oppløsning enn PALM/STORM, STED og SIM, kan den fortsatt oppnå en oppløsning på opptil ~ 120 nm (omtrent dobbelt så høy oppløsning som CLSM). Videre har denne mikroskopitilnærmingen med superoppløsning vist seg å ha en fordel i forhold til SIM og andre superoppløsningsteknikker når du ser på tykke prøver og prøver med et lavt signal-til-støy-forhold^47,48.

Airyscan er en relativt ny superoppløselig konfokal mikroskopiteknologi⁴⁶. I motsetning til tradisjonelle CLSMer, som bruker pinhole og enkeltpunktdetektorer for å avvise lyset utenfor fokus, bruker denne superoppløsningsmetoden en 32-kanals gallium arsenidfosfid (GaAsP) fotomultiplier rørområdedetektor som samler alt lyset i hver skanneposisjon⁴⁵. Hver av de 32 detektorene fungerer som et lite hull, noe som reduserer pinhole-størrelsen fra den tradisjonelle 1,0 Airy Unit (A.U.) til et forbedret 0,2 A.U., noe som muliggjør en enda høyere oppløsning og signal-til-støy-forhold, samtidig som effektiviteten til en diameter på 1,25 a.U.⁴⁵ opprettholdes. Videre resulterer den lineære dekonvolusjonen som brukes av Airyscan i opptil en 2x økning i oppløsning⁴⁵. Med tanke på dette er CLSM, og spesielt superoppløselig mikroskopi, godt egnet til å studere BM-proteiner og proteiner som regulerer basal avsetning av BM-proteiner, da de kan produsere svært høyoppløselige bilder for lokaliserings- og colokaliseringsstudier, og dermed gi ny innsikt i de romlige, tidsmessige og molekylære hendelsene som styrer disse prosessene.

En alternativ tilnærming til konfektmikroskopi som kan brukes til å utføre lokaliseringseksperimenter er bildedekonvolusjon. Siden widefield-mikroskopi gjør det mulig for lyset utenfor fokus å nå detektorene, kan matematiske og beregningsmessige dekonvolusjonsalgoritmer brukes til å fjerne eller tilordne lyset utenfor fokus fra bilder oppnådd ved widefield-mikroskopi, og dermed forbedre oppløsningen og kontrasten til bildet⁴⁹. Dekonvolusjonsalgoritmer kan også brukes på konfiskeringsbilder for å øke oppløsningen og kontrasten ytterligere, og produsere endelige bilder som nesten kan sammenlignes med superoppløsningsmikroskopi⁵⁰. Airyscan benytter seg av Weiner filterbasert dekonvolusjon sammen med Sheppards pikselomplassering, noe som resulterer i en svært forbedret romlig oppløsning og signal-til-støy-forhold. Sammenlignet med konfektmikroskopi observeres en økning på 2x i oppløsning i alle tre romlige dimensjoner (120 nm i x og y, og 350 nm i z) ved bruk av denne mikroskopiteknikken med superoppløsning^45,51.

Dette manuskriptet gir detaljerte og optimaliserte protokoller for å flekke, anskaffe og visualisere intracellulær smugling og avsetning av BM-proteiner ved hjelp av FE av Drosophila-eggstokken som et modellsystem kombinert med konfokal og superoppløselig mikroskopi. Drosophila linjer som uttrykker endogene tagget kjeller membran proteiner, for eksempel Vkg-GFP og Pcan-GFP, er effektive og nøyaktige verktøy for å visualisere BM protein trafficking og sekresjon. I tillegg kan de enkelt brukes i forskjellige genetiske bakgrunner, inkludert mutant og Gal4 / UAS linjer³⁴. Selv om endogent merkede kjellermembranproteiner anbefales, er bruk av antistoffer mot spesifikke BM-proteiner også kompatibel med de beskrevne protokollene. Disse protokollene er spesielt nyttige for forskere som er interessert i å studere intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner i intakt epitelvev ved hjelp av konfomisk og superoppløselig avbildning. Videre gjør evnen til å kombinere epitelvevsanalyse med de ekspansive verktøyene til Drosophila genetikk denne tilnærmingen spesielt kraftig. Til slutt kan disse protokollene enkelt tilpasses for å studere bilhandel og sortering av andre proteiner av interesse.

Protocol

1. Flyforberedelse for eggstokk disseksjoner Sett 10-15 Drosophila melanogaster kvinnelige fluer (1-2 dager gammel) av ønsket genotype i et smalt hetteglass som inneholder ~ 8 ml Drosophila fly medium sprinklet med en liten mengde granulert bakergjær 2-3 dager før disseksjon ved 25 °C. Å legge til noen menn til hetteglasset kan øke eggkammerutbyttet. Sørg imidlertid for at det totale antall fluer ikke overstiger 20, da dette kan påvirke eggstokkutviklingen negativt.<b…

Representative Results

Metodene beskrevet heri kan brukes til å effektivt og nøyaktig bilde og karakterisere intracellulær smugling og sekresjon av BM-proteiner i polariserte epitelceller, for eksempel FE av Drosophila eggstokken. Deretter gir vi forventede resultater oppnådd ved hjelp av de beskrevne metodene, samt nyttige råd og potensielle fallgruver. For å gjøre dette brukes Vkg-GFP, en endogenet merket Vkg (Drosophila Col IV). Imidlertid kan de samme resultatene oppnås med andre endogene taggede BM-proteiner som …

Discussion

BM er kritisk for embryonal og organmorfogenese, og voksne fysiologiske funksjoner. Videre fungerer BM som en signalplattform for etablering og vedlikehold av epitel polaritet og gir vev med støtte². Likevel er mekanismene som regulerer riktig plassering av BM-proteiner dårlig forstått. En bedre forståelse av de biologiske veiene dedikert til intracellulær smugling og polarisert sekresjon av BM-proteiner krever en nøye analyse av komponentene i disse veiene og deres roller i BM-prosessering….

Materials

Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing